Identification de phosphatases agissant sur la régulation de la phosphorylation de la « Leucine-Rich Repeat Kinase 2 », une kinase impliquée dans la maladie de Parkinson

Le gene codant la Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) compte parmi les determinants genetiques les plus importants de la maladie de Parkinson (MP). Les mutations de LRRK2 sont parmi les plus frequentes de la MP. La proteine LRRK2 est une proteine hautement phosphorylee dont les sites de phosphorylation heterologues (S910/S935/S955/S973) sont dephosphoryles dans le tissu cerebral de patients sporadiques, en presence de certains mutants pathogenes de LRRK2 et apres un traitement avec des inhibiteurs de la fonction kinase de LRRK2, une therapie potentielle de la MP. Par ailleurs, cette dephosphorylation est accompagnee d’une augmentation de l’interaction avec la phosphatase PPP1CA et une perte de liaison avec la proteine 14-3-3. Ces observations indiquent qu’il existe un desequilibre de la phosphorylation de LRRK2 dans la MP et que les phosphatases joueraient un role important dans la regulation de cette proteine. Les proteines phosphatases PP1 et PP2A sont des holoenzymes composees de sous-unites catalytiques et regulatrice et la composition precise des holoenzymes de phosphatases actives sur LRRK2 n’est pas connue. L'objectif de ce travail de these etait de determiner la composition precise des holoenzymes phosphatases regulant la phosphorylation de LRRK2.Ce travail s’appuie sur un criblage par genetique inverse des phosphatases effectue prealablement,qui a permis de definir un nombre de phosphatases candidates comprenant des sous-unites de PP1et PP2A. Nous avons dans un premier temps etudie l’interaction fonctionnelle entre LRRK2 et les differentes sous-unites de phosphatases candidates par des techniques d’immunocytochimie dans les cellules HEK-293T en conditions basales et de dephosphorylation. Un travail collaboratif nousa permis de realiser une cinetique de dephosphorylation de LRRK2 apres micro-injection de la phosphatase PP2A dans des ovocytes de Xenope. Enfin, le developpement et l’utilisation de la technologie CRIPSR-dCas9 ont permis de moduler l’expression endogene des differentes sous unites composant les holoenzymes dans des cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y.Les analyses de co-localisation et de Proximity Ligation Assay (PLA) ont permis de d’observer un recrutement des sous-unites de PP1 et PP2A dans le meme compartiment cellulaire que LRRK2.De plus, l’interaction entre LRRK2 et les sous-unite PPP1CA, PPP2CA, PPP2R2A et PPP2R2Best augmentee en condition de dephosphorylation. Nous avons ensuite montre que les combinaisons PPP2CA:PPP2R2A et PPP2CA:PPP2R2B dephosphorylaient efficacement LRRK2sur le site S935 par rapport a la condition controle et la condition PPP2CA seule et ce des 30minutes. Dans les cellules SH-SY5Y, la modulation de l’expression endogene des phosphatases a confirme l’importance des sous-unites regulatrices de PP1 et PP2A, respectivement PPP1R1B etPPP2R2A dans la regulation de la phosphorylation de LRRK2.En conclusion, ce travail de these a permis de confirmer l’implication de PP1 et reveler le role dePP2A dans la regulation de la phosphorylation de LRRK2. Nous avons demontre que l’holoenzymePPP2CA:PPP2R2A/B est un regulateur physiologique de LRRK2. Ces informations sont donc tres utiles pour mieux comprendre la cascade de signalisation de la proteine LRRK2, un determinant genetique clef de la MP.