β-frutofuranosidase de Cunninghamella echinulata PA3S12MM: purificação, caracterização bioquímica e aplicação na produção de açúcar invertido

Nos mais diversos setores industriais, o uso de enzimas tem sido cada vez mais requerido, substituindo diversos processos quimicos convencionais. Embora sejam cada vez mais empregadas, o elevado custo de enzimas comerciais muitas vezes acaba encarecendo etapas essenciais, tornando necessaria a busca por novas fontes enzimaticas. Neste contexto, os fungos se destacam como microrganismos promissores, uma vez que sao grandes produtores de diversas enzimas de alto valor agregado. Dentre as enzimas produzidas por estes organismos, encontra-se a β-frutofuranosidase (β-FFase), que catalisa a hidrolise da ligacao glicosidica α1↔2β da sacarose. Esta enzima apresenta aplicacoes em diversos setores industriais, como na producao de acucar invertido, mistura equimolar de glicose e frutose. Obtido a partir de um processo conhecido como inversao, o acucar invertido possui propriedades adocantes superiores a da sacarose, assim como melhor solubilidade e maior resistencia a cristalizacao e ao crescimento de microrganismos, sendo utilizado na fabricacao de bolos, paes, sorvetes, geleias e bombons de recheio pastoso. A producao de acucar invertido atraves da enzima β-FFase, embora origine um produto de elevada qualidade, apresenta custos consideraveis, sendo de fundamental importância a busca por novas fontes e metodologias que viabilizem a catalise enzimatica. Deste modo, os objetivos deste trabalho consistiram no screening enzimatico, otimizacao, purificacao, caracterizacao e aplicacao da β-FFase de Cunninghamella echinulata PA3S12MM na producao de acucar invertido. A partir dos ensaios de screening enzimatico, verificou-se que o fungo C. echinulata produz as enzimas poligalacturonase (20,8 e 16,06 U mL-1 ) e β-FFase (133,65 e 194,31 U mL-1 ) nos extratos extra e intracelular, respectivamente. A maior producao de β-FFase foi verificada em meio Vogel e as condicoes de cultivo foram otimizadas atraves do delineamento composto central rotacional, onde a maxima producao desta enzima foi alcancada quando o fungo foi cultivado por 8 dias a 28 °C e suplementado com 1% de casca de maca, alcancando 1054,85 U mL-1 . As melhores condicoes para pH e temperatura da enzima presente no extrato bruto foram pH 5,0 e 60 °C. A β-FFase foi purificada atraves de colunas de troca ionica e exclusao molecular e apresentou massa molecular relativa de 89,2 kDa, atividade maxima em pH 6,0 e temperatura de 60 °C, alem de apresentar estabilidade em pHs alcalinos e termoativacao a 50 °C. Foi verificado que a enzima e multifuncional, uma vez que hidrolisou diferentes substratos, e sua atividade aumentou na presenca de Mn2+ e DTT. Os valores aparentes de Km, Vmax e Kcat para hidrolise da sacarose foram 173,8 mmol L-1 , 908,7 mmol L-1 min-1 e 1388,79 s-1 , respectivamente. O conteudo de carboidratos da enzima purificada foi de 83,13% e a analise dos produtos de hidrolise e transfrutosilacao indicaram que a enzima foi eficaz na producao de glicose e frutose, mas nao apresentou atividade frutosiltransferase. A enzima imobilizada em alginato de calcio exibiu bons resultados na conversao da sacarose, mostrando-se promissora para aplicacoes industriais. Os resultados sugerem que C. echinulata PA3S12MM e um excelente produtor de β-FFase, com elevada atividade catalitica, estabilidade em pHs alcalinos, carater multifuncional, alem de exibir bons resultados na inversao da sacarose.