含RGD序列蛋白的表現及特性之研究，ADAM15與γ-雨傘節毒素

ADAM 15 (A Disintegrin And Metalloprotease 15) 又稱為metargidin (metalloprotease -RGD-disintegrin protein) 是一種型態I跨膜性醣蛋白 (type I transmembrane glycol- protein)。ADAM15 共含 814 個胺基酸，根據序列分析，ADAM15 共有前區域 (pro domain)、金屬蛋白區 (metalloprotease domain)、類去組合蛋白區 (disintegrin-like domain)、多半胱胺酸區 (cysteine-rich domain)、類上皮細胞生長因子區 (EGF-like domain)、跨膜區 (transmembrane domain) 以及細胞質區 (cytoplasmic domain) 等七個區域。ADAM15 的去組合蛋白區域是 ADAM 家族中唯一在去組合蛋白區中有 RGD 序列。文獻中指出 ADAM15 可利用去組合蛋白區上的RGDCD (胺基酸484至488) 序列與組合蛋白 (integrin) avb3、a5b1 發生交互作用。而既然 ADAM15 的去組合蛋白區可以當作組合蛋白中的 avb3 與 a5b1 的受體，因此它可能在發育與病理時期的細胞與細胞之間的交互作用上具有決定性的影響。有趣的是，含 91 個胺基酸 (胺基酸 420 至 510) 的去組合蛋白區中有 15 個半胱胺酸 (cysteine)；含 146 個胺基酸(胺基酸 511 至 656) 的多半胱胺酸區中有 13 個半胱胺酸以及兩個潛在的 N 連結醣化位置。去組合蛋白區與多半胱胺酸區 (胺基酸 420 至 656) 共含有 28 個半胱胺酸。 本實驗室假設多半胱胺酸區可能牽涉到與去組合蛋白區的雙硫鍵形成。而為瞭解ADAM15 去組合蛋白區與多半胱胺酸區的功能上結構關係，本實驗室決定大量表現並純化這些區域。我們從 Takada教授實驗室取得構築在大腸桿菌系統 pGEX-2T 上 ADAM15的去組合蛋白區之構築體。但是由大腸桿菌系統表現的蛋白並不適合作為多雙硫鍵蛋白之研究，因此本實驗室選擇將設計有His-tag的 ADAM15s (s表示secreted protein) 構築於pPICZaB載體上，以酵母菌系統 (Pichia pastoris) 表現，接著以鎳離子螯合親和性色層分析法、P-10管柱以及高效能液相層析分析法純化。根據實驗結果，發現此蛋白質會利用 RGDCD 序列中的半胱胺酸形成分子間的雙硫鍵，而產生二聚體，這證明 RGDCD 中的半胱胺酸可能與 ADAM15 中其他的半胱胺酸鍵結形成分子內雙硫鍵。為了避免二聚體的產生，首先我們將此半胱胺酸以定點突變的方式構築出C487S突變株，亦以酵母菌系統表現及純化，然後以用血小板凝集試驗測定其抑制血小板凝集的能力，當濃度高達50 mM時，仍沒有抑制血小板凝集的現象。以核磁共振與旋光光譜分析發現所純化到的C487S突變蛋白的折疊並不正確。接著我們構築出C端多五個胺基酸的ADAM15-96s，用以探討RGDCD序列的C487會與 ADAM15中的哪一個半胱胺酸鍵結。而根據質譜儀的結果，我們得到單體的ADAM15-96s，這證實本實驗室假設RGDCD序列能與ADAM15中其他的半胱胺酸鍵結而形成分子內雙硫鍵。但是以NMR研究，發現此蛋白質的結構並不正確。因此我們試著設計帶有His-tag的ADAM15-96i (i表示intracellular protein) 構築於pPICZC載體上，接著構築ADAM15-111s與ADAM15-127s於酵母菌系統，目前仍在進行純化ADAM15蛋白，本實驗室未來將繼續完成構築ADAM15去組合蛋白區與多半胱胺酸區於酵母菌系統和表現、純化、功能分析，以確定ADAM15中這兩個區域的功能與結構之關係。 另外本實驗室研究另一個含有 RGDGP 序列的蛋白：γ-Bungarotoxin。它最早是由Bungarus multicinctus 中純化而來，屬於一種蛇毒蛋白。它全長共有 68 個胺基酸，包括10 個多半胱胺酸 (cysteine residue) 以及在 33 至 37 位置上有一段 RGDGP 序列。根據本實驗室以 NMR 研究此蛋白質的結果，目前已經完成 γ-Bungarotoxin 的 3D 結構，並認為 γ-Bungarotoxin 的 3D 結構包含兩股與三股的 b-sheets (the double- and triple-stranded antiparallel b-sheets) 以及三個 loops. 其中位在 loop II 上的 RGD 序列能與 integrin 結合而形成一個 reverse turn 的結構，這結構與 disintegrin 的活化區類似。然而本實驗室秋月學姐將此蛋白做血小板凝集測試發現 γ-Bungarotoxin 的 IC50 值為 34 mM，比其它 disintegrin 減少 200 倍。因此我們構築 ADAM 15 (A Disintegrin And Metalloprotease 15) 又稱為metargidin (metalloprotease -RGD-disintegrin protein) 是一種型態I跨膜性醣蛋白 (type I transmembrane glycol- protein)。ADAM15 共含 814 個胺基酸，根據序列分析，ADAM15 共有前區域 (pro domain)、金屬蛋白區 (metalloprotease domain)、類去組合蛋白區 (disintegrin-like domain)、多半胱胺酸區 (cysteine-rich domain)、類上皮細胞生長因子區 (EGF-like domain)、跨膜區 (transmembrane domain) 以及細胞質區 (cytoplasmic domain) 等七個區域。ADAM15 的去組合蛋白區域是 ADAM 家族中唯一在去組合蛋白區中有 RGD 序列。文獻中指出 ADAM15 可利用去組合蛋白區上的RGDCD (胺基酸484至488) 序列與組合蛋白 (integrin) avb3、a5b1 發生交互作用。而既然 ADAM15 的去組合蛋白區可以當作組合蛋白中的 avb3 與 a5b1 的受體，因此它可能在發育與病理時期的細胞與細胞之間的交互作用上具有決定性的影響。有趣的是，含 91 個胺基酸 (胺基酸 420 至 510) 的去組合蛋白區中有 15 個半胱胺酸 (cysteine)；含 146 個胺基酸(胺基酸 511 至 656) 的多半胱胺酸區中有 13 個半胱胺酸以及兩個潛在的 N 連結醣化位置。去組合蛋白區與多半胱胺酸區 (胺基酸 420 至 656) 共含有 28 個半胱胺酸。 本實驗室假設多半胱胺酸區可能牽涉到與去組合蛋白區的雙硫鍵形成。而為瞭解ADAM15 去組合蛋白區與多半胱胺酸區的功能上結構關係，本實驗室決定大量表現並純化這些區域。我們從 Takada教授實驗室取得構築在大腸桿菌系統 pGEX-2T 上 ADAM15的去組合蛋白區之構築體。但是由大腸桿菌系統表現的蛋白並不適合作為多雙硫鍵蛋白之研究，因此本實驗室選擇將設計有His-tag的 ADAM15s (s表示secreted protein) 構築於pPICZaB載體上，以酵母菌系統 (Pichia pastoris) 表現，接著以鎳離子螯合親和性色層分析法、P-10管柱以及高效能液相層析分析法純化。根據實驗結果，發現此蛋白質會利用 RGDCD 序列中的半胱胺酸形成分子間的雙硫鍵，而產生二聚體，這證明 RGDCD 中的半胱胺酸可能與 ADAM15 中其他的半胱胺酸鍵結形成分子內雙硫鍵。為了避免二聚體的產生，首先我們將此半胱胺酸以定點突變的方式構築出C487S突變株，亦以酵母菌系統表現及純化，然後以用血小板凝集試驗測定其抑制血小板凝集的能力，當濃度高達50 mM時，仍沒有抑制血小板凝集的現象。以核磁共振與旋光光譜分析發現所純化到的C487S突變蛋白的折疊並不正確。接著我們構築出C端多五個胺基酸的ADAM15-96s，用以探討RGDCD序列的C487會與 ADAM15中的哪一個半胱胺酸鍵結。而根據質譜儀的結果，我們得到單體的ADAM15-96s，這證實本實驗室假設RGDCD序列能與ADAM15中其他的半胱胺酸鍵結而形成分子內雙硫鍵。但是以NMR研究，發現此蛋白質的結構並不正確。因此我們試著設計帶有His-tag的ADAM15-96i (i表示intracellular protein) 構築於pPICZC載體上，接著構築ADAM15-111s與ADAM15-127s於酵母菌系統，目前仍在進行純化ADAM15蛋白，本實驗室未來將繼續完成構築ADAM15去組合蛋白區與多半胱胺酸區於酵母菌系統和表現、純化、功能分析，以確定ADAM15中這兩個區域的功能與結構之關係。 另外本實驗室研究另一個含有 RGDGP 序列的蛋白：γ-Bungarotoxin。它最早是由Bungarus multicinctus 中純化而來，屬於一種蛇毒蛋白。它全長共有 68 個胺基酸，包括10 個多半胱胺酸 (cysteine residue) 以及在 33 至 37 位置上有一段 RGDGP 序列。根據本實驗室以 NMR 研究此蛋白質的結果，目前已經完成 γ-Bungarotoxin 的 3D 結構，並認為 γ-Bungarotoxin 的 3D 結構包含兩股與三股的 b-sheets (the double- and triple-stranded antiparallel b-sheets) 以及三個 loops. 其中位在 loop II 上的 RGD 序列能與 integrin 結合而形成一個 reverse turn 的結構，這結構與 disintegrin 的活化區類似。然而本實驗室秋月學姐將此蛋白做血小板凝集測試發現 γ-Bungarotoxin 的 IC50 值為 34 mM，比其它 disintegrin 減少 200 倍。因此我們構築 γ-Bungarotoxin 於 pPICZaB 載體上 (可分泌至細胞外) 以酵母菌系統 (Pichia pastoris) 表現，並以鎳離子螯合親和性色層分析法以及高效能液相層析分析法純化後，以研究其結構與功能之間的關係。 而根據過去本實驗利用 Pichia pastoris 表現系統來表現蛇毒 rhodostomin (具有六對雙硫鍵) 的研究，結果得到折疊正確結構的蛋白，但是對於ADAM15-96s (具有十六對雙硫鍵)、ADAM15-111s (具有十八對雙硫鍵) 以及 g-Bungarotoxin (具有五對雙硫鍵) 等蛋白的表現，卻是得到結構折疊錯誤的蛋白，因此我們認為 Pichia pastoris 表現系統並不適合表現所有具高度雙硫鍵結的蛋白。γ-Bungarotoxin 於 pPICZaB 載體上 (可分泌至細胞外) 以酵母菌系統 (Pichia pastoris) 表現，並以鎳離子螯合親和性色層分析法以及高效能液相層析分析法純化後，以研究其結構與功能之間的關係。 而根據過去本實驗利用 Pichia pastoris 表現系統來表現蛇毒 rhodostomin (具有六對雙硫鍵) 的研究，結果得到折疊正確結構的蛋白，但是對於ADAM15-96s (具有十六對雙硫鍵)、ADAM15-111s (具有十八對雙硫鍵) 以及 g-Bungarotoxin (具有五對雙硫鍵) 等蛋白的表現，卻是得到結構折疊錯誤的蛋白，因此我們認為 Pichia pastoris 表現系統並不適合表現所有具高度雙硫鍵結的蛋白。