1) 台灣南投地區痢疾桿菌菌株的毒性與流行性之研究(2) 珍珠內蛋白質之檢測與鑑定

摘要 (題目一) 自 1996 到 2000 年間，台灣南投地區爆發了大規模的桿菌性痢疾流行事件，分離到 180 株 S. flexneri 2a 菌株。Not I-脈衝式電泳分子分型得到分屬 52 型的174株遺傳相近的菌株，6 株遺傳不相近的菌株。在 174株遺傳相近的菌株中，其中74 株為 A型，稱為流行菌株，另外 100 株分屬 51 種的A1~A51型，稱為非流行菌株。本部分的研究為探討 173 株 S. flexneri 2a 的毒性與流行性的關聯 (一株分離株死亡)。 首先隨機挑選 10 株菌的單一菌落培養菌液 (1st-day colony cultures)，及其連續培養 10 天的任意一菌株 (10th-day colony cultures)，以 MOI 50 的菌數感染 U-937 及 Caco-2 細胞後，檢測菌在胞內複製能力及對 U-937 細胞的傷害程度，及菌中毒性蛋白IpaB 蛋白的表現。結果顯示：可以表現 IpaB 蛋白的 5 株 1st-day colony cultures 及 1 株 10th-day colony cultures，在二細胞內皆有較高複製能力，及對 U-937 細胞產生較強的傷害。另外不能表現 IpaB 蛋白的 5 株 1st-day colony cultures 及 9 株 10th-day colony cultures，在二細胞內的複製能力較低，對 U-937 細胞的傷害亦較低。但是這些現象與菌是否為流行菌株無關，與是否為第十天的菌株有關，大部分的流行或非流行菌株連續培養 10 天的菌，會喪失 IpaB 蛋白的表現能力。 隨機挑選一株能表現 IpaB 蛋白的流行菌株的 1st-day colony culture，感染 Caco-2 細胞進行 plaque assay，發現菌株具有強的細胞間擴散能力，但其 10th-day colony culture 不能表現 IpaB 蛋白，亦不能在細胞間擴散，而由 -80℃ stock 直接培養的菌液 (1st-day stock culture)，其連續培養 10 天的菌液 (10th-day stock culture)，也發現相同的結果。另外挑選可以表現 IpaB 的 2 株流行菌株及 4 株非流行菌株的 1st-day stock culture，檢測其細胞間擴散的能力，發現一株流行菌株具有強的細胞間擴散能力，另外一株流行菌株其 4 株非流行菌株只具有弱的細胞間擴散能力。 檢查 173 株 1st-day stock culture 及 10th-day stock culture 其 IpaB 蛋白的表現。結果顯示，73 株流行菌株 1st-day stock culture 中，52 株 (71.2%) 有 IpaB 蛋白的表現，但是只有 9 (12.3%) 株 10th-day stock culture 有 IpaB 蛋白的表現。而非流行菌株也有類似的情形，100 株非流行菌株 1st-day stock culture 中，75株 (75%) 有IpaB 蛋白的表現，但是只有 16 (16%) 株10th-day stock culture 有 IpaB 蛋白的表現。 檢測173 株分離株 1st-day stock culture 對 32 株人類腸道常在菌的殺菌能力，發現有 65 株 (89%) 的流行菌株可毒殺一株 E. coli (F-34)，其中有 63 株還可毒殺另二株 E. coli (F-21，F-24) 中的一株或兩株。而非流行菌株中，只有 46 株 (46%) 具有殺 F-34，其中有 21 株還可毒殺另二株 F-21、F-24 中的一株或兩株。1996 到 2000 年中，除了 1999 年外，具有殺菌能力的流行菌株百分比逐年升高， 在 1998 到 2000 年，非流行菌株的殺菌能力則是逐年下降。在 1996 到 1999 年的分離株中，每年任選流行及非流行各 6 株分離株，以及 2000 年的全部菌株，檢查其 10th-day stock culture 的殺菌能力穩定性，發現其殺菌能力幾乎與 1st-day stock culture 相同。 將不具殺菌力的菌液 (rifampicin-resistant) 以 0.1%，1%，10% 加入具殺菌力的菌液 (rifampicin-sensitive) 中，連續培養五天，發現 rifampicin-resistant的菌會分別佔到 12.1%，54.3% 及89.4%，其中分別有 25%，3% 及1.67% 具有毒殺 F-34 的能力，顯示不具毒性的族群會侵略具有毒性的族群，而導致整個族群皆不具毒性。因此，我假設有一株具有殺菌能力的 S. flexneri 2a 菌株，引起南投地區的痢疾大流行，這株菌具有高度毒性並可以在流行期間被分離出 (其中一株流行菌株)，而在流行期間可感染腸道細胞但不具殺菌能力的突變株會逐漸產生，導致分離出許多不同類型低毒性的菌株 (非流行菌株)。 本部分第二章的研究為選取一具殺菌能力的菌株，分離及定性殺菌基因。我將173 株分離株的 Not I-脈衝式電泳圖譜與分離株對大腸桿菌 F-34 毒殺能力相比對，發現在 Not I-PFGE 圖譜中第 31 個 DNA 片段可能具有殺菌基因。將具殺菌能力的 SH3160 的 Not I-PFGE 圖譜中第 31 個 DNA 片段製作成 fosmid library，找到兩個可毒殺 F-34 的菌落 pBacin1/EPI300 及 pBacin2/EPI300，後者的殺菌能力較前著強。以 Tn5 對殺菌能力較強的clone (pBacin2/EPI300) 進行隨機突變，篩選不具殺菌能力的插壞株，找到殺菌基因為 cib (編碼出的蛋白為大腸桿菌素 Colicin Ib)。南方雜配及 SH3160 全基因定序結果顯示：SH3160 中的 cib 基因位於一個 ColIb-P9-like 的大型質體上。我以接合生殖實驗證實：此 ColIb-P9-like 質體可於自 E. coli 自我轉移於至 S. flexneri 2a 中或反之。將純化的重組 Col Ib 蛋白對 32 株人類腸道常在菌進行殺菌能力測試，發現有 6 株 E. coli (包括 F-34、F-21、F-24) 對 Col Ib 具有敏感性。 本部分第三章的研究為找尋能夠幫助 Col Ib 蛋白分泌至菌體外的基因或蛋白。上述以Tn5對殺菌能力較強的clone (pBacin2/EPI300) 進行隨機突變，得到的不具殺菌能力的插壞株中。除了cib 基因插壞株外，還有ibfA 基因插壞株。然而目前對於 ibfA 基因的了解較少。以 PCR 檢測殺菌能力較弱的clone (pBacin1/EPI300) 發現不具 ibfA 基因。將 ibfA 基因互補至 pBacin1/EPI300 中，可發可提升其抑菌能力。因此 ibfA 基因應可表現 trans-acting factor。大量表現 IbfA 或 Colicin Ib 的免疫蛋白 (Imm 蛋白)，會引發菌體發生 quasi-lysis 現象。以細菌雙雜交系統檢測 Colicin Ib 蛋白、Imm 蛋白及 IbfA 蛋白在菌體是否具交互作用，發現三者並無交互作用。 摘要 (題目二) 珍珠及珍珠製品除了美觀具有收藏價值外，在中國亦是一種傳統藥物及保健食品。珍珠與貝類中的珍珠母 (nacre，或稱珍珠層) 有著相似的化學成分，目前在珍珠母中，有超過 20 種蛋白被鑑定出，但卻沒有任何一種蛋白在珍珠中被發現。因此，本實驗室與台灣的美梭科技公司合作，目的為開發一種能夠偵測及鑑定珍珠內的蛋白的萃取技術。兩批珍珠分別購自兩個不同的三角帆蚌 Hyriopsis cumingii (Lea) 養殖場，先將珍珠研磨成 >10,000 mesh 的珍珠粉，再經由 RTSES 系統將珍珠粉中的顆粒震碎並溶於水中，經離心後的上清液即為珍珠水萃取液。將珍珠水萃取液以 121℃ 加熱處理 20 分鐘或不經熱處理，再利用 TCA 沉澱其中的珍珠蛋白，以 tricine SDS-PAGE 分離蛋白片段。膠體經硝酸銀染色後，在經 121℃ 加熱處裡的珍珠水萃取液的樣品中有明顯的蛋白訊號，但沒有經過121℃ 加熱的珍珠水萃取液則沒有任何蛋白訊號。將兩次獨立實驗經 121℃ 加熱處理的珍珠萃取液蛋白，分別自膠體中挖出，經由 tryptic 切割，再利用質譜儀分析蛋白片段，分析結果以 MASCOT 軟體進行比對搜尋。發現其中一個蛋白與貽貝 (Mytilus edulis) 的 putative vitelline envelop receptor for lysine 蛋白有顯著的序列同源性，另一個蛋白與象鼻蟲 (Diaprepes abbreviatus) 的 putative imaginal disc growth factor (IDGF) 蛋白有顯著的序列同源性。