A photoactivated adenylyl cyclase as an optogenetic tool to manipulate neuronal signaling and synaptic plasticity

To improve our understanding of brain function, temporally and spatially precise manipulation of neurons and neuronal circuits is needed. This is limited with standard methods based on pharmacological manipulations and electrophysiology. In recent years, novel optogenetic tools have become available which promise to facilitate more precise spatiotemporal control of neuronal activity and signaling. In this thesis, I introduce bPAC (Beggiatoa photoactivated adenylyl cyclase), a member of a new class of optogenetic actuators which I characterized in hippocampal neurons. bPAC is a soluble adenylyl cyclase, which produces cAMP upon illumination with blue light. It allows for manipulation of intracellular cyclic AMP signaling, a ubiquitous second messenger system important for neuronal plasticity, learning and memory. bPAC is small compared to similar optogenetic tools (350 amino acids) and very light sensitive, which are desirable attributes in an optogenetic actuator, commending it for in vivo and in vitro applications. I expressed bPAC in hippocampal organotypic slice cultures using different gene delivery techniques which allow for sparse or regionally limited expression. Neurons express bPAC well and I could reliably use bPAC to elevate intracellular cAMP levels in a controlled manner to concentration ranges similar to what can be achieved with canonical pharmacological tools. Optogenetic cAMP elevation activated conductances underlying slow inward current in these neurons, which was in large part due to cAMP modulation of hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated (HCN) channels. Under elevated cAMP concentrations, miniature EPSC frequency, but not amplitude, increased reversibly in CA1 cells. These effects were acute and not lasting. To study the effects of postsynaptic cAMP signaling on neuronal plasticity, I used two approaches: 1) intracellular recordings in postsynaptic neurons with presynaptic channelrhodopsin stimulation, and 2) paired recordings of unitary synaptic connections between two hippocampal pyramidal cells. I show that elevation of postsynaptic cAMP alone is not sufficient to induce synaptic potentiation, nor to modulate plasticity induction in a theta burst protocol. Taken together, cAMP is a viable tool to elevate neuronal cAMP levels and to study intracellular second messenger signaling with unprecedented temporal and spatial precision. Methoden zur raumlich und zeitlich prazisen Manipulation von Nervenzellen sind wichtig, um unser Verstandnis des Gehirns und seiner Funktionsweise voranzutreiben. Mit den pharmakologischen und elektrophysiologischen Standardmethoden ist dies nur eingeschrankt moglich. In den letzten Jahren stehen zunehmend neuartige optogenetische Werkzeuge zur Verfugung, welche eine grosere raumlich-zeitliche Kontrolle uber neuronale Aktivitat und Signalwege versprechen. In dieser Arbeit stelle ich bPAC (Beggiatoa photoaktivierte Adenylatzyklase) vor, Teil einer neuen Klasse von optogenetischen Effektoren, und charakterisiere bPAC in hippocampalen Neuronen. bPAC ist eine losliche Adenylatzyklase, die bei Beleuchtung mit blauem Licht zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) herstellt. Die Lichtabhangigkeit erlaubt eine nicht-invasive Manipulation von intrazellularen cAMP-abhangigen Signalkaskaden, einem ubiquitaren Second-Messenger-System, welches unter anderem fur neuronale Plastizitat, Lernen und Gedachtnis wichtig ist. bPAC ist klein im Vergleich zu ahnlichen optogentischen Effektoren (350 Aminosauren) und sehr lichtempfindlich, zwei wertvolle Attribute in einem optogenetischen Werkzeug, wodurch bPAC fur in vivo und in vitro Anwendungen geeignet ist. Ich benutzte verschiedenen Transfektionstechniken, um bPAC in organotypischen Kulturen in einzelnen Neuronen oder in spezifischen Regionen des Hippocampus zu exprimieren. Ich konnte zeigen, dass mittels bPAC die intrazellulare cAMP-Konzentration in einer kontrollierten und reproduzierbaren Art und Weise erhoht werden kann. Dabei konnen ahnliche cAMP-Konzentrationen wie mit klassischen pharmakologischen Methoden erreicht werden. Optogenetische Erhohung der cAMP-Konzentration fuhrt zu einer Offnung von Membrankanalen und zu einem langsamen Einwartsstrom, welcher zu einem grosen Teil durch cAMP-abhangige Modulation von hyperpolarisationsaktivierten zyklonukleotid-gesteuerten Kanalen (HCN) verursacht wird. Wahrend der lichtinduzierten erhohten cAMP-Konzentration in CA1 Neuronen steigt die Frequenz, jedoch nicht die Amplitude von Miniatur-EPSCs reversibel an. Diese Effekte sind akut und reversibel. Um die Auswirkungen der postsynaptischen cAMP-Signalkaskaden auf neuronale Plastizitat zu untersuchen, verfolgen wir zwei Ansatze: 1) Intrazellulare Messungen, kombiniert mit Channelrhodopsin-Stimulation, und 2) Messung der synaptischen Verbindung zwischen zwei hippocampalen Pyramidenzellen(paired-patch Experimente). Ich konnte zeigen, dass die Erhohung von postsynaptischem cAMP nicht ausreicht, um eine synaptische Potenzierung zu induzieren. Die Induktion synaptischer Plastizitat durch Theta-Burst Stimulation war durch postsynaptische cAMP Erhohung ebenfalls nicht verandert. Zusammenfassend lasst sich sagen, das bPAC ein neues und auserst potentes Werkzeug ist, um die cAMP-Konzentration in individuellen Nervenzellen kontrolliert zu erhohen und dadurch intrazellulare Signalwege mit hoher zeitlicher und raumlicher Prazision zu untersuchen.