高灵敏苯并(a)芘-DNA加合物分析方法研究及应用

苯并(a)芘（B(a)P）是一种典型的多环芳烃类污染物，具有潜在的致突变、致癌性。苯并(a)芘在生物体内经代谢活化过程，可生成最终活化产物邻二醇环氧苯并(a)芘（BPDE）。BPDE与DNA链上的脱氧鸟苷共价结合，形成稳定的BPDE-N2-dG加合物。DNA加合物在致癌过程中处于一个核心的地位，若形成的DNA加合物不能及时的修复，可引起基因突变，最终导致癌症的发生。因此，DNA加合物作为一种重要的生物标志物，对研究环境致癌物暴露的致癌机制以及健康风险评价都有着十分重要的意义。一般来说，在环境中苯并(a)芘的含量一般较低，在生物体内所引起的DNA加合物的含量相应的更低，每108 ~ 109个正常碱基中仅含有1个加合物，并且可供分析的DNA样品量一般只有几个或十几微克，这对DNA加合物检测方法是一个巨大的挑战。因此，发展高灵敏和高特异性的苯并(a)芘-DNA加合物检测方法是开展相关研究的一个重要基础，也是本文的主要研究目标。全文共分为五个章节，主要内容为： 第一章 介绍了苯并(a)芘-DNA加合物在生物体内的形成及其与癌症的关系。并以苯并(a)芘-DNA加合物为例，着重介绍了四种常用的DNA加合物检测方法（32P-后标记法、免疫学法、色谱-质谱联用法、毛细管电泳法）及其应用。 第二章 发展了一种毛细管柱上聚焦的高灵敏DNA荧光分析方法。采用不连续的TGA-TG缓冲液对，可以使POPO-3染料嵌合标记的DNA分子在未涂层和聚丙烯酰胺涂层毛细管中进行聚焦分离，从而显著的提高了DNA分析的分离效率及检测灵敏度。以小牛胸腺DNA（3.5 kb）为例，其最低检测限可达到7.9 fM。并且该聚焦方法还可应用于无胶尺寸筛分毛细管电泳分离DNA片段。此外，选用的TGA和TG缓冲液对还有利于促进POPO-3-DNA复合物的形成，并在毛细管电泳分离过程中减少POPO-3-DNA复合物的解离。 第三章 发展了一种量子点增强的免疫CE-LIF高灵敏DNA加合物分析方法。该方法采用量子点标记的二抗作为荧光探针，与一抗结合后可特异性的识别BPDE-DNA加合物，形成QD-Ab-DNA加合物三元免疫复合物。通过优化的毛细管电泳聚焦条件，在没有筛分介质存在的自由溶液毛细管电泳中，即可将QD-DNA加合物免疫复合物与未结合的QD完全分离开。与高灵敏的柱上激光诱导荧光检测相结合，BPDE-DNA加合物的质量检测灵敏度可以达到6.6 t 10-21 mol，浓度检测灵敏度可以达到120 fM。该方法一次电泳分析只需消耗5 ng DNA，并且无需耗时费力的DNA酶解及放射性标记等操作。由于具有检测灵敏度高、特异性强等优点，该方法成功地应用于痕量BPDE（0.1 nM）、B(a)P（1 nM）及0.1支香烟烟气暴露条件下A549肺癌细胞中产生的BPDE-DNA加合物的定量检测；痕量B(a)P环境暴露下红线虫（L. variegatus）体内BPDE-DNA加合物的定量检测；以及中国太原地区健康人群白细胞内痕量BPDE-DNA加合物的定量检测。并且该方法还成功地应用于DNA加合物修复机理的初步研究。与正常的小鼠ES细胞相比，敲除型ES细胞对BPDE-DNA加合物的修复能力得到了明显的抑制。 第四章 发展了一种快速、高灵敏的多标记放大的免疫磁珠方法用于BPDE-DNA加合物和整体DNA甲基化水平的检测。该方法以磁性微珠为固相介质，通过免疫亲和的方式将DNA加合物分子富集在磁性微珠的表面，利用简单快速的磁性分离方法，有效的将DNA加合物与大量的未损伤DNA分离。再采用荧光嵌合染料直接对富集在磁性微珠表面的DNA加合物进行多位点标记，以提高荧光信号强度和分析灵敏度。该方法具有灵敏度高、DNA用量少、分析速度快等优点，其检测灵敏度可达到1个BPDE-DNA加合物每109个核苷，分析所需DNA用量很少（l 3 mg），并且1小时内即可完成整个分析过程。因此，该方法成功地应用于测定低浓度BPDE暴露的A549细胞中以及中国太原地区健康人白细胞DNA样品中BPDE-DNA加合物的含量。此外，采用抗甲基胞嘧啶抗体，免疫磁珠方法成功地应用于整体DNA甲基化水平的检测。 第五章 总结了本文所发展的两种B(a)P-DNA加合物检测方法，并对其今后的应用前景进行了展望。 总之， 文中发展的两种苯并(a)芘-DNA加合物检测方法具有高灵敏度和高特异性等优点，将为环境致癌物的暴露监测、癌症风险评价和癌症预防等研究提供重要的分析测试手段。