Visualisierung proteinspezifischer Glycosylierung in lebenden Zellen

Die Glycosylierung von Proteinen ist eine weit verbreitete posttranslationale Modifikation, die an der Regulation vieler Proteinfunktionen beteiligt ist. Um die biologischen Funktionen dieser Modifikation zu verstehen, ware die Visualisierung des Glycosylierungszustandes spezifischer Proteine in lebenden Zellen von entscheidender Bedeutung. Bisher wurde dies noch nicht erreicht. Hier zeigen wir die Detektion proteinspezifischer Glycosylierung der intrazellularen Proteine OGT, Foxo1, p53 und Akt1 in lebenden Zellen. Unser breit anwendbarer Ansatz beruht auf der Fluoreszenzmarkierung intrazellularer, metabolisch eingebauter Kohlenhydrate durch Diels-Alder-Chemie. Die gewahlten Proteine sind mit grun fluoreszierendem Protein (EGFP) markiert. Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie (FLIM) gestattet die Detektion von Forster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen EGFP und dem am Glycan gebundenen Fluorophor mit hohem Kontrast selbst in Gegenwart des grosen Uberschusses an Akzeptorfluorophor.