14-3-3/HIP-55复合体增强HIP-55蛋白稳定性

目的：用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术验证HIP-55与14-3-3在HEK293细胞中存在相互作用,并进一步研究其生物学意义。方法：利用GATEWAY系统构建PDEST-N-Venus-HIP-55WT（野生型）,PDEST-N-VenusHIP-55AA（突变体S269A/T291A）,PDEST-GST-HIP-55WT及PDEST-C-Venus-14-3-3τ重组质粒,利用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术检测两者的相互作用,同时应用14-3-3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突变体（HIP-55AA突变体S269A/T291A不能与14-3-3相互作用）作为工具研究两者结合后对嘌呤霉素诱导的HIP-55蛋白表达的影响。结果：外源转入的Venus-HIP-55WT、Venus-HIP-55AA及Venus-14-3-3蛋白能够在HEK293细胞中表达;双分子荧光互补实验结果表明HIP-55与14-3-3存在相互作用,HIP-55蛋白的S269/T291位点介导HIP-55与14-3-3的相互作用;免疫共沉淀技术表明内源性HIP-55与14-3-3存在相互作用;进一步研究发现HIP-55与14-3-3复合体增强HIP-55蛋白的稳定性,保护HIP-55不被降解。结论：14-3-3与HIP-55存在相互作用,14-3-3/HIP-55复合体可以促进HIP-55蛋白的稳定性。