Regulación de la funcionalidad de k-ras4b por unión a cam y fosforilación de la ser 181

A partir de los resultados previos de nuestro grupo, para la realizacion de esta tesis nos planteamos estudiar la interaccion entre K-Ras y CaM, con el objetivo de generar un mutante de K-Ras que no uniese CaM y nos permitiera determinar la funcion que ejerce CaM sobre esta GTPasa. Definimos tres regiones de interaccion entre estas dos proteinas, la region hipervariable de K-Ras, la ?-helice 5 y el Switch II. Los distintos mutantes generados nos permitieron determinar que la interaccion directa con CaM no alteraba la distribucion celular de K-Ras y que este seguia localizandose en la membrana plasmatica. En 1987 se describio que K-Ras podia ser fosforilado, apuntando que podria ser en la Serina 181. Generamos una construccion que mimetizara esta fosforilacion y observamos que no podia unirse a CaM. Muchas proteinas como MARCKS, p21cip1 o EGFR sufren una regulacion dual por la fosforilacion y la union a CaM. Es decir, CaM y la fosforilacion juegan papeles antagonicos, de manera que la fosforilacion impide la union a CaM y CaM evita la fosforilacion de dichas proteinas. Quisimos comprobar si esta era la funcion que estaba ejerciendo CaM sobre K-Ras y efectivamente corroboramos esta hipotesis. Una vez demostrado que CaM inhibe la fosforilacion de K-Ras y que la fosforilacion impide la union a CaM, nos propusimos determinar la funcion de la fosforilacion en la Serina 181 sobre la actividad de K-Ras, y demostramos que: -La fosforilacion induce la activacion de K-Ras. -El mutante no fosforilable presenta una cinetica de activacion menos sostenida a lo largo del tiempo. -Este efecto se debe a que la fosforilacion disminuyes la capacidad de las GAPs para hidrolizar el GTP de K-Ras. -La senalizacion celular mediada por K-Ras tambien se ve alterada por esta fosforilacion, ya que la imposibilidad de fosforilar a K-Ras disminuye la activacion de la via PI3K/AKT a bajas concentraciones de mitogenos. -Estas diferencias en el perfil de activacion son importantes para la correcta proliferacion celular, ya que si no se puede fosforilar, las celulas disminuyen su capacidad de proliferacion en un 50%, siempre y cuando la presencia de estimulos no sea saturante, es decir a bajas concentraciones de factores de crecimiento. -La fosforilacion, al igual que la union a CaM, no altera la distribucion intracelular de K-Ras. -La fosforilacion tambien modula la funcionalidad de la forma oncogenica de K-Ras: - Estimula la capacidad transformante. - Estimula la movilidad celular. - Estimula la supervivencia celular al dano en el DNA. - Estimula la proliferacion y supervivencia a bajas concentraciones de factores de crecimiento, ya que tras dos dias de deprivacion las celulas que expresan K-Ras oncogenico o K-Ras oncogenico pseudo-fosforilado proliferan, pero si expresan la forma no fosforilable no solo no proliferan, sino que se mueren. Debido a una insuficiente activacion del avia Raf/MEK/ERK y la via PI3K/AKT. Finalmente, hemos iniciado un estudio de como la fosforilacion puede alterar a la distribucion de K-Ras en la propia membrana plasmatica. Y hemos observado que a bajas concentraciones de factores de crecimiento, si K-Ras no se puede fosforilar presenta un difusion lateral mas elevada, comparable a la que se obtiene en condiciones de quiescencia, mientras que la forma fosforilable ha enlentecido esta difusion lateral, asemejandose mas a la movilidad obtenida en condiciones de estimulacion total. Todos estos resultados indican que la fosforilacion de K-Ras modula la actividad de esta GTPasa., tanto de la forma salvaje, como de la forma oncogenica. Y que esta fosforilacion es esencial en condiciones de estimulacion no saturantes para la correcta proliferacion, movilidad y supervivencia celular.