基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3)囊膜蛋白 ORF 65基因全长1 785 bp，编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上，将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成，将合成的截短 ORF 65 (truncated ORF 65) 插入pET32a (+)载体，构建了pET32a-trunORF65；进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段，以合成的截短 ORF 65为模板，通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a (+)载体，构建了pET32a-modORF65。重组质粒分别转入BL21 (DE3)菌株，经IPTG诱导，SDS-PAGE和Western-blot分析，pET32a-modORF65获得高效表达，表达的融合蛋白分子量为56.4 kD。此外，利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤( Cyprinus carpio haematopterus )血清IgM，免疫小鼠，制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体。在上述研究的基础上，将纯化的pORF65作为包被抗原，鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体，建立了间接ELISA方法，该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。