慢病毒介导 shRNA 沉默鼠肝星状细胞 TGFβ1 对 α1I型胶原表达的影响

目的构建大鼠转化生长因子β1（transforminggrowthfactor，TGFβ1）基因RNA干扰慢病毒载体，并观测其对大鼠肝星状细胞HSC-T6的TGFβ1基因沉默效应与对I型胶原仪1（alpha．1typeIcollagen，Collod）表达的影响。方法针对大鼠TGFβ1基因CDs序列，筛选3个干扰靶点，合成其3对小干扰RNA（siRNA），将各对siRNA分别转入HSC—T6细胞，采用RT-PCR法从3对siRNA中筛选出最佳siRNA，设计并合成针对最佳siRNA靶序列的shRNA，退火形成双链，与载体pGreenPuro连接，构建pGreenPuro／TGFβ1shRNA慢病毒载体，予以酶切与测序鉴定。pGreenPuro／TGFβ1 shRNA慢病毒载体经293细胞包装，将包装产生的高感染力的慢病毒颗粒感染HSC．T6细胞，倒置显微镜观察经感染的HSC—T6细胞的GFP表达情况，在mRNA与蛋白水平检测重组慢病毒pGreenPuro／TGFβ1 shRNA对HSC．T6细胞的TGFβ1基因的沉默效应及对Collα1表达的影响。结果筛选到TGFβ1基因的最佳干扰靶序列。酶切与测序结果证实，构建pGreenPuro／TGFDlshRNA慢病毒载体成功。HSC—T6细胞经pGreenPuro／TGFβ1 shRNA慢病毒感染48h后，RT—PCR检测未见TGFβ1基因表达，Collα1基因较弱表达；Westernblot检测显示TGFβ1、Collα1蛋白表达均非常弱。结论成功构建大鼠TGFβ1基因RNA干扰慢病毒载体，该载体能有效沉默HSC．T6细胞的TGFβ1 基因，并抑制Collα1的表达。