Validação de método bioanalítico por HPLC para a determinação do ácido ursólico em plasma

Introducao: No Brasil, o unico farmaco disponivel para tratamento da doenca de Chagas e o benzonidazol. No entanto, alem dos efeitos adversos graves e longo tempo de tratamento, este farmaco e eficaz somente na fase aguda da doenca. Estudos recentes tem apontado que o acido ursolico possui atividade sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares de T cruzi, criando expectativas para uso terapeutico do composto. A investigacao do seu perfil farmacocinetico e fundamental para a continuidade desses estudos e requer a disponibilidade de um metodo bioanalitico com limites de confianca adequados. Objetivos: Desenvolver e validar um metodo bioanalitico para quantificar acido ursolico em plasma por HPLC. Metodologia: Foi utilizado um sistema de cromatografia liquida Acquity HPLC equipado com detector UV-Vis, operando a 225 nm , coluna Waters SunFireTM C8 (4.6 x 250mm, 5μm). A fase movel foi constituida de acetonitrila e agua (70:30) e fluxo de 0,5 mL/min em modo isocratico, com tempo de corrida de 20 minutos. As amostras foram mantidas a 25 °C e a coluna a 35 °C durante a separacao cromatografica. 100μL de plasma foram adicionados 1000 μL de acido tricloroacetico (TCA) 10% e 20 μL de padrao interno (P.I) (Diazepam 100 μL diluido em acetonitrila). A mistura foi agitada em vortex por 30 segundos e centrifugada a 12.000 rpm, com controle de temperatura a 4°C por 15 minutos. 150 μL do sobrenadante foram adicionados de 500 μL de cloroformio e a mistura foi centrifugada a 12.000 rpm por 15 minutos. 400 μL da fase orgânica foram evaporados a secura. O residuo foi ressuspendido em 100 μL de fase movel e 2μL foram injetados no sistema HPLC-UV. A validacao do metodo foi realizada de acordo com as normas estabelecidas pela ANVISA (RDC 27/2012) e da Food and Drug Administration (FDA), de acordo com o guidance for industry: Bioanalytical Method Validation, de maio de 2001. Resultados e discussao: A linearidade do metodo foi de 050 -3000 ng/mL, a equacao da reta foi y=0,55512X-0,00248 obtida por ponderacao (1/x2), o coeficiente de correlacao foi de 0,9925 e exatidao entre 85-115%. O LIQ foi de 50ng/mL com precisao (CV 10,236%) e exatidao (101,85%). Os controles de qualidade baixa (CQB), media (CQM) e alta (CQA) foram, respectivamente, 150 ng/mL, 1500 ng/mL, 2500 ng/mL. Precisao e exatidao inter e intraensaio dos controles de qualidade se mostraram dentro dos criterios de aceitacao. O metodo bioanalitico foi seletivo para o acido ursolico. O farmaco foi estavel durante o estudo de estabilidade de curta duracao de 6 horas em temperatura ambiente, de longa duracao de 30 dias a 20oC, de pos-processamento de 6 horas e apos 3 ciclos de congelamento e descongelamento. Conclusao: O metodo bioanalitico demonstrou limites de confianca adequados para a quantificacao de acido ursolico em plasma e permitir a validacao do metodo para a analise farmacocinetica.