VD 3 羟化酶及其电子传递链的体外构建及活性研究

活性维生素D3具有广泛生理活性及药用价值,利用分子操作技术,在大肠杆菌细胞中重组表达VD3羟化过程的关键酶体系,是实现活性维生素D3生物法合成的有效手段。构建了来源于自养无枝酸菌(Pseudonocardia autotrophica)VD3羟化酶(Vdh, EC 1.14.13.159)及来源于不动杆菌(Acinetobacter sp. OC4)的铁氧还蛋白Fdx及铁氧还蛋白还原酶FdR的重组表达载体pET28b-Vdh、pET28b-FdR-Fdx,以大肠杆菌为宿主细胞,体外诱导表达并通过镍柱纯化三种蛋白质,通过CO差光谱法评价羟化酶Vdh体外活性,并利用2,6-二氯靛酚钠(DCIP)和细胞色素c作为电子受体评价电子传递链FdR-Fdx对NADH和NADPH的氧化活性及与羟化酶Vdh的偶联作用,最后利用Vdh及其电子传递链催化维生素D3的选择性羟化合成25(OH)VD3。