Dynamique enzymatique et contrôle de la formation et de la distribution des branchements de l’amidon

Chez Arabidopsis thaliana, deux genes codent des enzymes de branchement (BE) BE2.2 et BE2.1 responsables de la formation des liaisons α-1,6 de l’amidon transitoire synthetise dans la feuille de la plante. Ces enzymes, appartenant a la famille GH13_8 de la classification CAZy, agissent en clivant une liaison α-1,4 d’un glucane puis en transferant la chaine clivee en position α-1,6 selon un mecanisme d’action qui peut etre intra ou intermoleculaire. Dans ce travail, une caracterisation enzymatique et structurale des BEs d’A. thaliana (classees de type II d’apres leur sequence en acides amines) a ete realisee et les resultats compares a ceux de la BE d’E. coli (GlgB, enzyme de type I).L'etat oligomerique, la forme en solution et l’organisation structurale des BEs ont ete evalues par une approche SAXS. Par des analyses spectrophotometriques, le pH, la temperature, mais aussi le KM pour l’amylose et l’amylopectine ont ete determines. Une analyse sur gel de polyacrylamide, en conditions natives, a permis d’evaluer le comportement electrophoretique des BEs en presence ou en absence de ces substrats et d’en determiner leur constante d’affinite (Ks). Notre etude revele que les BEs d’ A. thaliana ont plus d'affinite pour l’amylopectine que pour l’amylose contrairement a GlgB. En presence d’un substrat branche, des changements d’oligomerie et/ou de la conformation des BEs d’A. thaliana ont ete observes. Finalement, des analyses en chromatographie echangeuse d'anions ont permis de determiner la taille minimale du substrat necessaire a l’activite des BEs et la taille des chaines transferees. Les resultats obtenus pointent vers un mecanisme d’action intramoleculaire de BE2.2.