Caracterización estructural y funcional de dos metalo-carboxipeptidasas de la familia M14 con especifidad de sustrato tipo acídico : carboxipeptidasa citosólica 6 y carboxipeptidasa O humanas

Las metalo-carboxipeptidasas (MCPs) son exopeptidasas que contienen un atomo de zinc en el centro activo y que participan en la hidrolisis de enlaces peptidicos C-t de peptidos y proteinas. La carboxipeptidasa A1 (CPA1) fue la primera peptidasa M14 identificada y se aislo hace mas de 80 anos a partir de extractos de pancreas. Desde entonces, el numero de MCPs pancreaticas y extra-pancreaticas pertenecientes a esta familia ha ido incrementandose considerablemente. En mamiferos, estas enzimas estan relacionadas con un amplio rango de procesos biologicos, como la digestion de proteinas, la regulacion de la fibrinolisis en la sangre, la maduracion de neuropeptidos, o el procesamiento especifico de la tubulina, entre otras funciones. En esta tesis hemos llevado a cabo la caracterizacion bioquimica, funcional y/o estructural de dos MCPs de la familia M14 con una especificidad de sustrato tipo acidico: la carboxipeptidasa citosolica 6 (hCCP6) y la carboxipeptidasa O (hCPO) humanas. Estas MCPs han sido muy poco estudiadas debido a su descubrimiento reciente, y en parte, a la dificultad para su produccion recombinante. Este hecho hace que exista un vacio de conocimiento acerca de los determinantes estructurales que definen la especificidad de sustrato por residuos acidicos C-t en las MCPs de la familia M14. Por ello, nuestro trabajo se ha centrado principalmente en el estudio de las caracteristicas estructurales que determinan la preferencia de sustrato por residuos acidos C-terminales en la hCCP6 y la hCPO, ademas de otros aspectos relacionados con su funcion especifica e inhibicion por inhibidores especificos. En el capitulo I presentamos la caracterizacion bioquimica y funcional de la hCCP6, una exopeptidasa intracelular que modifica post-traduccionalmente la tubulina que forma parte de los microtubulos celulares, participando asi en la regulacion de su estabilidad y funcionalidad. Ademas de la tubulina, tambien es capaz de actuar sobre otros sustratos intracelulares como la quinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK1) y la teloquina. El trabajo realizado, contribuye notablemente al conocimiento acerca de la funcion y estructura de la hCCP6, a la vez que asienta las bases para establecer nuevas lineas de investigacion que ayuden a comprender los mecanismos de regulacion existentes in vivo para modular los niveles de poliglutamilacion en la tubulina de los microtubulos y la identificacion de nuevos sustratos endogenos para la hCCP6. En el capitulo II mostramos la primera estructura tridimensional de la hCPO, una nueva MCP digestiva de la familia M14 que actua complementando la accion digestiva de las MCPs pancreaticas mediante la hidrolisis de residuos acidos C-t de proteinas y peptidos procedentes de la dieta. Gracias a este trabajo, hemos podido comprender mejor las caracteristicas estructurales que determinan la preferencia de la hCPO por la hidrolisis de enlaces peptidicos C-terminales de residuos acidos. Ademas, la obtencion de la estructura de la hCPO en complejo con el inhibidor de carboxipeptidasas de Nerita versicolor (NvCI), nos ha permitido conocer en detalle el mecanismo de accion de este inhibidor de la hCPO. Finalmente, en este capitulo se presentan distintas aproximaciones bioquimicas que se han llevado a cabo para caracterizar la especificidad de sustrato de esta enzima e investigar su rol funcional en su localizacion intestinal en humanos.