应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒

目的：应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人生长分化因子-5（GDF-5）基因重组腺病毒载体，并在 HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法将PCR获取的GDF-5基因插入到质粒pMD19-T中，基因测序鉴定后将目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CM V ，Hind Ⅲ酶切鉴定。重组质粒经 PmeⅠ酶切使之线性化并去磷酸化处理，电转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183，使其在细菌内发生同源重组，卡那霉素筛选，Hind Ⅲ酶切鉴定阳性克隆，扩增重组腺病毒质粒，并转染 HEK293细胞，包装成重组腺病毒Ad-GDF-5，分别采用Western blot、TCID50法对Ad-GDF-5进行蛋白鉴定和滴度测定。结果经PCR扩增得到的GDF-5大小约为1．7 kb ，基因测序结果证实该基因与GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CM V-GDF-5、pShuttle-CM V-GDF-5-AdEasy-1经 Hind Ⅲ酶切后均得到大小约为1．7 kb的片段，与GDF-5大小相符。Western blot证实Ad-GDF-5感染HEK293细胞后大量表达成熟GDF-5蛋白。研究结果表明成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体，并制备出5．6＆#215;109 PFU/mL的重组腺病毒。结论利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5，为进一步研究GDF-5的生物学功能及其相关疾病的基因治疗奠定了基础。