Inhibition of Leukocyte and Platelet Aggregation in vitro by Antithrombin

Summary: Glycosaminoglycan-mediated aggregation of cells occurs through adhesion mechanisms in which heparan sulfate chains bind to counter receptors on these cells. As antithrombin interacts with heparan sulfate proteoglycans through its heparin-binding domain and inhibits leukocyte adhesion in ischaemia/reperfusion, it may affect leukocyte aggregation. Leukocyte aggregation was therefore monitored in vitro as the increase in transmission of light through stirred suspensions in a platelet aggregometer. Aggregation curves were quantified as the area under the curve in the first 6 min following stimulation. Leukocytes in platelet-rich plasma were obtained from heparinized whole blood of healthy donors by centrifugation; the ratio of leukocytes to platelets was about 1 : 45, and the final concentration of autologous plasma was 80 %. Neutrophils were purified by dextran sedimentation, density centrifugation, and hypotonic lysis of erythrocytes. Aggregation was induced by phytohaemagglutinin (0.24 mg/mL) or formyl-Met-Leu-Phe (0.2 × 10–6 M), with or without various concentrations of antithrombin. During the observation period (6 min) no aggregation of leukocytes in platelet-rich plasma or isolated neutrophils could be induced either with medium or with antithrombin (0.2 × 100 to 0.2 × 10–6 IU/mL). Addition of phytohaemagglutinin or formyl-Met-Leu-Phe stimulated aggregation of leukocytes in platelet-rich plasma and neutrophils to different extents. Additional presence of antithrombin significantly inhibited phytohaemagglutinin-induced aggregation of leukocytes in platelet-rich plasma, whereas formyl-Met-Leu-Phe-induced aggregation was not affected by antithrombin. Data show that in the presence of plasma and platelets, aggregation of normal white blood cells after stimulation with lectin but not with chemotaxin is inhibited by antithrombin, suggesting specific interactions of antithrombin with lectin-activated processes of neutrophil aggregation that occur in the presence of platelets and/or plasma. Zusammenfassung: Glukosaminoglykane ermoglichen uber heparansulfatabhangige Bindung homo- und heterotypische Aggregation von Zellen. Nachdem Antithrombin mit seiner Heparinbindungsstelle Affinitat fur Heparansulfatproteoglykane hat und in vivo beobachtet werden konnte, das Antithrombin die Adhasion und Aggregation von Leukozyten bei Ischemie/Reperfusion hemmt, konnte Antithrombin unabhangig von Endothel Leukozytenaggregation beeinflussen. Es wurde daher die In-vitro-Leukozytenaggregation in einem Lichttransmissions-Aggregometer untersucht. Dabei wurden Aggregationsmeskurven der ersten sechs Minuten nach Auslosung als „Flache-unter-der-Kurve” analysiert. Leukozyten in plattchenreichem Plasma wurden aus heparinisiertem venosem Blut gewonnen, wobei das Verhaltnis von Leukozyten zu Blutplattchen circa 1 : 45 betrug; die endgultige Plasmakonzentration war 80 %. Neutrophile Granulozyten wurden mittels Dextran-Sedimentation von Erythrozyten gereinigt und in nachfolgender Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Die Aggregation der Zellen wurde mit dem Lektin Phytohamagglutinin (0.24 mg/mL) oder dem Chemotaxin Formyl-Met-Leu-Phe (0.2 × 10–6 M) mit oder ohne zusatzliches, unterschiedlich konzentriertes Antithrombins ausgelost. Mit Antithrombin alleine (0.2 × 100 to 0.2 × 10–6 IU/mL) konnten weder eine Aggregation von Leukozyten in plattchenreichem Plasma noch von gereinigten Neutrophilen ausgelost werden. Phytohamagglutinin und Formyl-Met-Leu-Phe stimulierten die Aggregation von Leukozyten in plattchenreichem Plasma sowie von reinen Neutrophilen in unterschiedlichem Ausmas. Eine zusatzliche Anwesenheit von Antithrombin hemmte die Aggregation von Leukozyten in plattchenreichem Plasma, wogegen die Aggregation von gereinigten Neutrophilen (Abwesenheit von Plasma und Plattchen) nicht signifikant beeinflust wurde. Die Ergebnisse zeigen, das Antithrombin in Gegenwart von Plattchen und Plasma die Aggregation von Leukozyten hemmen kann. Diese Wirkung bleibt auf die lektin-ermittelte Aggregation beschrankt und wurde nicht beobachtet, wenn die Aggregation mit Formyl-Met-Leu-Phe ausgelost wurde, was eine besondere Wechselwirkung von lektinbindenden Oberflachenmolekulen mit Heparansulfatproteoglykanen, die durch Antithrombin verandert werden, anzeigen konnte.