Implication de la cytométrie en flux quantitative et de la microscopie à sectionnement optique 3D à fluorescence dans l'exploration des récepteurs d'adhérence leucocytaires : applications à différents domaines pathologiques

Les recepteurs d'adherence constituent les acteurs essentiels de l'interaction leucocyte-cellule endotheliale. Leur fonctionnalite implique des variations quantitatives du niveau de leur expression ainsi que des redistributions spatiales. Ce travail a eu pour but d'explorer le comportement de ces recepteurs pour des leucocytes de sujets sains et pathologiques a l'aide d'une double approche methodologique. Dans la premiere partie methodologique, nous avons mis au point un protocole standardise de mesure, par cytometrie en flux quantitative, cle l'expression des [beta]2 integrines CD11 a,b,c/CD18 et de la L-selectine, a la surface des polynucleaires neutrophiles. Ceci nous a permis d'apprehender l'importance de l'influence des parametres pre-analytiques sur cette mesure et d'etablir les valeurs de references pour des temoins. L'utilisation de la microscopie a sectionnement optique a fluorescence 3D nous a permis de connaitre la distribution spatiale de ces recepteurs, avec une distribution heterogene a l'etat basal et un regroupement en "clusters" apres stimulation par le TNF[alpha]. Dans une deuxieme partie, nous avons utilise la cytometrie en flux quantitative, pour explorer ces recepteurs d'adherence leucocytaires dans differents domaines pathologiques impliquant, soit un defaut d'expression, soit un etat d'activation leucocytaire (surexpression de l'expression [beta]2 integrines associee a une diminution de la L-selectine). Nous avons ainsi trouve un deficit, portant a la fois sur l'expression de [beta]2 integrines CD11 b/CD18 et sur la selectine CD62L, et regressif sous G-CSF, chez un patient atteint de glycogenose lb. Ce resultat, rapporte a notre connaissance pour la premiere fois, contribue a expliquer, en association avec les autres anomalies fonctionnelles leucocytaires, la survenue des complications infectieuses ainsi que l'efficacite de la therapie par facteurs de croissances. Ensuite, notre etude sur les monocytes de patients atteints de cirrhose alcoolique nous a permis de mettre en evidence un phenotype d'activation pour les monocytes circulants avec une diminution du ratio d'activation pour CD11 b/CD18. Ces donnees illustrent que la pathogenese de cette maladie est probablement liee a un processus inflammatoire en reponse a l'alcool et/ou a ses metabolites. La diminution du potentiel reactif des monocytes contribue a expliquer la susceptibilite de ces patients a presenter des complications infectieuses. La quantification de l'expression des recepteurs d'adherence a la surface de polynucleaires neutrophiles incubes en presence d'hemoglobines modifiees a montre que ces nouveaux transporteurs d'oxygene n'entrainaient pas, in vitro, d'activation leucocytaire. Cette etude nous a donc permis de montrer que cette methodologie etait tout a fait adaptee a l'exploration du phenotype leucocytaire, en terme de marqueur d'activation. Enfin, nous avons elabore, en collaboration avec une societe commerciale, une trousse de quantification de l'expression de CD11 b afin de standardiser au maximum sa mesure et de pouvoir realiser des comparaisons inter-laboratoires et/ou longitudinales. Son application dans le domaine de la pathologie infectieuse a permis de valider son utilisation en terme de sensibilite, specificite et facilite d'utilisation. L'ensemble de ces etudes nous a permis de connaitre les interets et limites de la quantification antigenique a l'aide d'un calibrant standardise et d'envisager elargir son application pour d'autres types cellulaires et d'autres domaines d'applications.