小白杏自交不亲和基因 S-RNase 的克隆及正、反义表达载体的构建

本研究以新疆栽培杏品种小白杏( Prunus armeniaca  L. cv.)为试验材料，利用特异引物(索柱full1/索柱full2)扩增 S 66 -RNase (GenBank登陆中)。将 S 66 -RNase (cDNA)插入到克隆载体pMD19-T后，获得pMD- S 66 -RNase ，借助中间表达载体PBS-T，利用两次双酶切( Hind III/ Bam HI和 Kpn I /Bam HI)连接，将克隆的 S 66 -RNase 基因片段(cDNA)正向插入到pCAMBIA中，构建 S 66 -RNase 基因正义表达载体pCAMBIA-Sense- S 66 -RNase ；利用pMD-Antise- S 66 -RNase 与pCAMBIA上一致的酶切位点( Hind III和 Bam HI)，通过酶切连接的方法，将克隆的 S 66 -RNase 基因片段(cDNA)反向重组到表达载体中，构建 S 66 -RNase 基因反义表达载体pCAMBIA-Antise- S 66 -RNase ；用电击转化法将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。结果显示，通过RT-PCR获得739 bp的 S 66 -RNase 基因(cDNA)片段，其ORF长度为672bp(第44-714bp)。对两个表达载体进行酶切检验显示， S 66 -RNase 基因(cDNA，739bp)正确地插入到pCAMBIA的CaMV35S启动子和NOS终止子之间，表明 S 66 -RNase 基因的正义、反义表达载体构建成功；经PCR限制性内切酶酶切和测序鉴定表明本研究也成功地将 S 66 -RNase 基因正义和反义两种表达载体转入农杆菌LBA4404中。在本研究中，克隆出了 S 6 6 -RNase 的ORF ， 获得了 S 66 -RNase 的正义和反义表达载体，为深入的研究果树 S-RNase 基因功能和自交不亲和机制的提供了帮助。