Fit-1胞外III区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定

本研究旨在克隆和表达人血管内皮生长因子受体-1胞外Ⅲ区蛋白，并测定其生物学活性。应用RT-PCR法从人脐静脉内皮细胞中克隆Flt-1胞外Ⅲ区基因片段，经测序鉴定后再克隆到原核表达载体pAYZ中，构建出的表达载体pAYZflt-1 Ⅲ转化大肠杆菌16C9后，用低磷培养基诱导表达目的蛋白；采用E-tag亲和层析柱纯化目的蛋白：用SDS-PAGE、Western blotting和BCA法对其进行定性、定量检测鉴定；用ELISA、损伤愈合试验和Transwell法检测靶蛋白生物学活性。克隆的Flt-1胞外Ⅲ区基因经测序鉴定正确。所构建的pAflt-1 Ⅲ表达载体经低磷培养基诱导后高表达出可溶性Flt-1胞外Ⅲ区蛋白，产量约为1．1mg／L；ELISA结果显示该蛋白可以结合VEGF165，并表现为剂量依赖性，其与配体结合的解离常数托为1．180pmol／L。损伤愈合试验和Transwell结果显示该蛋白可以抑制VEGF165（50ng／m1）和bFGF（100ng／mL）诱导的脐静脉内皮细胞的迁移，并呈剂量依赖性。这将为今后开展人flt-1基因Ⅲ区的功能研究及其单抗研制奠定了实验基础。