Nachweis Archaea-typischer Lipide in Bacteria über die Aufklärung der Funktion von AraM und PcrB aus Bacillus subtilis

Der Entwicklungsstand der Sequenziertechnik erlaubt mittlerweile die Entzifferung eines bakteriellen Genomes innerhalb weniger Tage. In der nun beginnenden post-genomischen Ara ist es eine der wichtigsten Herausforderung den Produkten der identifizierten Gene Funktionen zuzuordnen. In dieser Arbeit wurde zur Aufklarung der Funktion von Enzymen ein integrativer Ansatz verfolgt. Dabei wurden Methoden der Bioinformatik, Genetik und Mikrobiologie mit den analytischen Techniken der physikalischen Biochemie kombiniert. Als Kandidat zur Funktionsaufklarung wurde das (βα)8-Fass-Protein PcrB aus B. subtilis gewahlt. PcrB hat hohe Ahnlichkeit zu einem Schlusselenzym der archaeellen Membranlipidsynthese, der Geranylgeranylglycerin-Phosphat-Synthase (GGGPS), die die stereospezifische Kondensation von Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) und Glycerin-1-Phosphat (G1P) katalysiert. Ausgangspunkt fur die Aufklarung der Funktion von PcrB bildete der Vergleich der Kristallstrukturen von PcrB und der GGGPS aus Archaeoglobus fulgidus (afGGGPS), aus dem G1P als ein Substrat auch von PcrB abgeleitet werden konnte. Mit AraM als Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase konnte das G1P produzierende Enzym in B. subtilis identifiziert werden. Mit dessen Hilfe wurde unter Verwendung der Enzyme der Glycolyse aus 14C-markierte Glucose 14C-G1P synthetisiert und uber Papierchromatographie prapariert. Mit dem markierten Substrat G1P konnte somit die Aktivitat von PcrB in in vitro und in vivo Experimenten untersucht werden. Zum einen wurde damit in vitro die GGGPS-Aktivitat von PcrB G1P-abhangig nachgewiesen. Um die Fahigkeit von PcrB zu untersuchen den Umsatz langerer Polyprenylpyrophosphate (C25-C30) als das bereits getestete C20-GGPP zu katalysieren, wurde diese Substrate uber eine mutierte Polyprenylpyrophosphatsynthease ebenfalls synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass PcrB diese ebenfalls umsetzen konnte. Im Vergleichsenzym afGGGPS konnte in einem ahnlichem Experiment die Funktion eines bislang nur postulierten Aminosaurerestes als essentiell fur die Begrenzung der Substratlange und damit der Spezifitat von afGGGPS belegt werden. Um das native Substrat und das Produkt von PcrB in B. subtilis zu bestimmen wurden Inkorporationsversuche mit 14C-G1P durchgefuhrt. Verglichen wurde dabei der B. subtilis Wildtyp Stamm und ein genomischer knockout Stamms ΔpcrB. Nach Extraktion und Analyse uber Dunnschichtchromatographie konnten drei mogliche hydrophobe Produkte von PcrB identi¬fiziert werden. Zur Steigerung der Signalstarke wurde pcrB in B. subtilis rekombinant exprimiert, uber HPLC die drei Produkte nichtradioaktiv prapariert und uber Massen¬spektrometrie und NMR-Spektroskopie identifiziert. Es konnte C35-Heptaprenylglycerinphosphat als das native Reaktionsprodukt von PcrB bestimmt werden. In der Zelle liegt dieses dephosphoryliert und zum Teil einfach bzw. doppelt acetyliert vor. Die entsprechende Prozessierung wird uber zwei weitere, noch nicht naher charakterisierte Proteine geleistet. Uber Zellfraktionierung wurde die Lokalisation der Produkte in der Zellmembran von B. subtilis nachgewiesen. Mit Hilfe von molekuldynamischen Rechnungen konnte eine Theorie fur die Spezifitat von PcrB fur das Substrat Heptaprenylpyrophosphat formuliert werden. Diese geht von einer Fixierung des planaren Endes des Substrates uber Stapelkrafte an ein spezifisches Tyrosin am Ende der Bindetasche aus. Zusammenfassend konnte damit zum ersten Mal Polyprenyl-Glycerin-1-Phosphat-Ether auserhalb der Domane der Archaea nachgewiesen. Gestutzt auf Sequenzvergleiche und in vitro Versuche ist davon auszugehen, dass die Ergebnisse auch auf die PcrB Enzyme anderer gram-positiver Bacillales zu ubertragen sind. Eine mogliche Funktion der gefunden Heptaprenylglycerinderivate konnte in der Regulation der Membranrigiditat oder der Adhasion der Organismen an Oberflachen liegen. Diese Hypothesen sollen nun in Zusammenarbeit mit mikrobiologisch orientierten Arbeitsgruppen uberpruft werden.