Regulation and characterization of membrane protein channels and translocation of biologically active compounds

Resumen de la tesis (Spanish) Objeto y objetivos de la investigacion El principal objetivo de la presente Tesis es caracterizar la actividad de transporte de diferentes canales ionicos, asi como regular dicha actividad de transporte. Por otro lado la Tesis abarca el estudio del transporte a traves de bicapas de moleculas con alto potencial biologico. En este sentido la presente Tesis abarca diferentes sistemas de estudio que comparten la capacidad de interactuar con las membranas lipidicas dando como resultado el transporte ionico a traves de la formacion de poros, o bien por medio de la translocacion a traves de la propia membrana. Los objetivos concretos que recoge este trabajo son: 1) Estudio de la regulacion del transporte ionico a traves de canales mesoscopicos como la porina OmpF. Las proteinas transmembrana formadoras de canales constituyen el medio de comunicacion de las celulas, por lo que la capacidad de regular sus funciones de transporte es clave para la construccion de dispositivos biologicos que puedan utilizarse en aplicaciones biotecnologicas varias. 2) Caracterizacion de la actividad de canal ionico de proteinas transmembrana procedentes de virus respiratorios. Estas proteinas conocidas como viroporinas estan involucradas en el proceso de infeccion viral, por lo que la descripcion de su actividad de canal es un paso imprescindible en la investigacion de su papel en el proceso infeccioso. En esta Tesis se investiga la proteina de envuelta (E) del virus que produce el Sindrome Respiratorio Agudo y Grave (SARS), y la proteina hidrofobica (SH) del virus Sincitial Respiratorio (h VSR). 3) Analisis de la influencia de la carga de la membrana lipidica en la actividad de canal ionico de dos canales diferentes, como son los formados por la porina OmpF y la proteina E del SARS. 4) Estudio del transporte de moleculas con propiedades anfipaticas a traves de bicapas lipidicas. En este punto se investiga como un metalcarborano que contiene boro en su estructura es capaz de atravesar las bicapas lipidicas. Dicho metalcarborano puede ser utilizado como agente anticancerigeno en la terapia conocida como BNCT, Boron-neutron capture therapy. Planteamiento y metodologia utilizados El estudio y caracterizacion de la regulacion y transporte de las proteinas formadoras de canal se han llevado a cabo a partir de medidas electrofisiologicas experimentales. El procedimiento experimental se basa en la tecnica de reconstitucion de canales conocida como voltage-clamp. A partir de esta tecnica la proteina formadora de canal se reconstituye en una bicapa lipidica artificial. Para conseguirlo, se utiliza una celda con dos compartimentos separados por un film de Teflon de 12 a 15 µm de grosor donde hay un orificio de unos 100-200 µm de diametro. Es en este orificio donde el canal se reconstituye. Aportaciones originales Pese a que la reconstitucion electrofisiologica de canales es una tecnica que ha sido ampliamente utilizada para investigar la actividad de transporte de los canales ionicos, la presente Tesis presenta como novedad los sistemas que trata. En este sentido, la caracterizacion de la actividad de canal ionico de las viroporinas es un tema emergente del que actualmente hay pocas publicaciones. Por otro lado, esta Tesis tambien trata de correlacionar dicha actividad de canal ionico con la infeccion viral, es decir, se combina la reconstitucion electrofisiologica con otras tecnicas de biologia molecular para poder analizar como la funcion de canal influye en el proceso de infeccion viral. Tambien la investigacion de la translocacion de compuestos anfipaticos a traves de bicapas lipidicas utilizando la tecnica voltaje-clamp es un tema novedoso y pionero, pues hasta este momento no se habia empleado esta tecnica para el estudio del transporte de este tipo de moleculas a traves de membranas artificiales. Por ultimo tambien resulta novedoso el uso de un canal ionico para regular sus propiedades de transporte aprovechando la interaccion de iones multivalentes con el canal. Conclusiones y futuras lineas de investigacion Las principales conclusiones de esta Tesis doctoral son: 1) La actividad de transporte del canal OmpF puede ser regulada por la presencia de sal de lantano. Bajo la presencia de cloruro de lantano tanto la conductancia como la selectividad ionica del canal son modificadas. Asi, se ha conseguido regular a voluntad la funcion de transporte de una canal biologico, lo cual puede tener importantes aplicaciones biotecnologicas. 2) La actividad de canal ionico de la proteina de envuelta del SARS esta relacionada en la patogenesis viral. Este punto es de vital relevancia para la investigacion del mecanismo de infeccion del virus y el posible desarrollo de vacunas. 3) Se ha descrito el primer inhibidor de la actividad de transporte para la proteina hidrofobica del virus sincitial, lo cual tiene una gran importancia para la investigacion de posibles candidatos a vacunas contra el virus. 4) Se ha descrito por primera vez la translocacion de un metalcarborano a traves de bicapas artificiales. Dicho metalcarborano tiene interes biomedico para su uso en radioterapia para el tratamiento de determinados canceres. Su estudio es de vital importancia para el desarrollo de nuevas alternativas.