Amélioration de l'amplification dépendante d'hélicase par ingénierie des protéines

L'amplification dependante d'helicase (HDA) est une nouvelle technologie d'amplification d'acide nucleique basee sur la capacite des helicases a derouler les doubles brins d ADN et des polymerases a synthetiser l'ADN complementaire a partir d'amorces, pour l'amplification d'une sequence specifique a temperature constante. La version thermophile utilisee actuellement (tHDA) necessite l'helicase UvrD de Thermoanaerobacter tengcongensis (TteUvrD) et le grand fragment de la polymerase I de Bacillus stearothermophilus (Bstpol) pour l'amplification d'un fragment d ADN de moins de 200 pb en 90 min a 65oC. Dans le but d ameliorer les performances de la tHDA, TteUvrD et Bstpol ont ete modifiees par ingenierie des proteines suivant deux approches. La premiere approche visait a ameliorer la coordination des enzymes en concevant une nouvelle proteine bifonctionnelle ou helimerase. Les helimerases sont des complexes non-covalents de deux proteines de fusions, dans lesquelles helicase et polymerase sont chacune fusionnees a un des deux domaines d'une superhelice pour leur dimerisation. Les resultats obtenus en tHDA avec les proteines de fusion ou les helimerases ont revele l'importance de la coordination des enzymes pour l'amplification de longs fragments d ADN : seules les enzymes du complexe helimerase sont capables d'amplifier de tres longs amplicons, jusqu a 2. 3 kb (Motre et al. 2008). De plus, les deux helimerases, qui different par la nature d une des etiquettes, ont toutes deux montre l'amelioration de la solubilite, thermostabilite et activite specifique des proteines de fusion dans le complexe. La seconde approche consistait a modifier chaque enzyme separement, par mutation specifique ou fusion avec des proteines qui se lient a l'ADN. Il semble que l'efficacite de l'helicase et de la polymerase en tHDA ont toutes deux ete significativement ameliore par l'addition de Sso7d, une proteine de liaison a l'ADN double brin de Sulfolobus solfataricus. Enfin, l'analyse des differentes constructions presentees dans cette etude a permis la decouverte des facteurs cles de l'amplification d ADN dans les reactions tHDA, dont pourront beneficier de futures recherches