Biosenseurs fluorescents appliqués à l’étude de la fonction du réticulum sarcoplasmique dans le couplage excitation-contraction du muscle squelettique

La cascade d’evenements permettant la contraction de la fibre musculaire striee squelettique en reponse a l’activite electrique de sa membrane plasmique est regroupee sous le terme de couplage excitation-contraction (EC). Le couplage EC a lieu au niveau des triades, domaines nanoscopiques au niveau desquels les invaginations transversales de la membrane plasmique (tubules-T) sont en contact etroit avec deux citernes terminales adjacentes de reticulum sarcoplasmique (RS). Plus precisement, lors de l’excitation d’une fibre musculaire, un potentiel d’action se propage dans toute la surface de la membrane plasmique et en profondeur de la cellule via les tubules-T. Cette depolarisation y est detectee par les proteines membranaires sensibles au potentiel Cav1.1 qui en retour, par couplage mecanique, declenchent l’ouverture des canaux calciques du RS que sont les recepteurs de la ryanodine de type 1 (RYR1s). Ceci est a l’origine de l’augmentation massive de Ca2+ intracellulaire qui declenche l’activation des myofilaments et donc la contraction. La comprehension des mecanismes de controle et de regulation des canaux RYR1s reste encore aujourd’hui limitee. En particulier, la mesure de l’activite physiologique de ces canaux dans la fibre musculaire intacte est toujours realisee de maniere tres indirecte. Par ailleurs le role eventuel de variations de potentiel de la membrane du RS pendant l’activite musculaire n’a jamais ete revele. Une connaissance approfondie de ces phenomenes est pourtant essentielle a la comprehension de la fonction musculaire squelettique normale et pathologique. Dans ce contexte, l’objectif general de mon projet de these a ete de mettre au point et utiliser des biosenseurs fluorescents localises specifiquement a la membrane des citernes terminales du RS de fibres musculaires differenciees – par leur fusion a une sequence d’adressage appropriee. Grâce a la combinaison des techniques d’electrophysiologie et d’imagerie de la fluorescence des biosenseurs sur fibres musculaires isolees, nous avons pu etudier l’activite du RS au cours de la fonction musculaire. Plus particulierement, mon travail de these aborde deux problemes biologiques principaux : le potentiel de membrane du RS et la signalisation calcique du RS au cours du couplage EC. Le premier objectif a vise a caracteriser les changements de potentiel de la membrane du RS pendant l’activation du couplage EC. Pour cela, nous avons utilise des biosenseurs de FRET de la famille Mermaid. Nos resultats montrent qu’il n’y a pas de changement substantiel du potentiel transmembranaire du RS pendant l’activation du couplage EC. Ces donnees confirment – pour la premiere fois en condition physiologique – que le flux de Ca2+ a travers les canaux RYR1s est equilibre par des contre-flux ioniques compensatoires qui permettent le maintien du potentiel de membrane du RS. Ceci assure la perennite du flux de Ca2+ et contribue a l’efficacite du couplage EC. Le deuxieme objectif a vise a detecter les variations de concentration en Ca2+ a proximite immediate des canaux RYR1s. Pour cela, nous avons utilise le biosenseur fluorescent sensible au Ca2+ GCamP6f. Le biosenseur adresse a la membrane du RS fournit un acces unique a l’activite individuelle de populations distinctes de canaux RYR1s au sein de differentes triades d’une meme fibre musculaire. Au-dela de la caracterisation detaillee des proprietes des sondes GCaMP6f dans cette preparation, nos resultats montrent la stupefiante synchronisation de l’activite de liberation de Ca2+ des triades d’une meme fibre musculaire au cours du couplage EC. Les resultats ouvrent des perspectives particulierement interessantes pour les etudes de situations pathologiques d’alteration de l’activite des canaux RYR1s