Die Rolle der humanen Serinprotease HTRA1 in der Regulation von Zellzyklus und Apoptose

Die humane Serinprotease HTRA1 steht mit vielen verschiedenartigen Erkrankungen in Verbindung. Ein Verlust von HTRA1 bzw. der HTRA1 Aktivitat wird beispielsweise in diversen Tumorerkrankungen und der Erbkrankheit CARASIL beschrieben. Beobachtete pleiotrope Phanotypen von Zellen mit verringerter HTRA1 Expression beinhalten ein verstarktes Zellwachstum, Zentrosomen Amplifikationen und Polyploidie. Diese Beobachtungen deuten auf wichtige Funktionen von HTRA1 in regulatorischen Prozessen hin. Die Expression des HTRA1 Gens ist in vielen Tumorarten negativ reguliert. Ein in vivo Experiment in K‑ras mutierten aggressiven Tumor-Mausmodellen zeigte jedoch, entgegen des bis dahin postulierten tumorsuppressiven Einflusses von HTRA1, einen protektiven Effekt eines Htra1 Knockouts in Abhangigkeit der K-ras Mutation. Daruber hinaus wurden die Kinasen B‑RAF und C‑RAF in einem PDZ-optimierten Peptidscreen als potentielle HTRA1 Liganden identifiziert. Im Rahmen dieser Dissertation wurde deshalb die Interaktion von HTRA1 mit dem ERK-Signalweg in humanen Kolonkarzinomzellen (SW480) analysiert, die stabil verschiedene Level von HTRA1 exprimierten. Dabei konnte eine Interaktion von HTRA1 und C-RAF in den Lysaten von SW480 Zellen, sowie die Bildung eines Komplexes aus rekombinantem HTRA1 und der RAS-Bindedomane (RBD) von C-RAF in vitro nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation der Proteine in humanen Zellen scheint nach einer Analyse der Zellen mittels konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie moglich. Auserdem wurde die RBD von C-RAF als ein in vitro Substrat von HTRA1 identifiziert. Ein Effekt von HTRA1 auf die Aktivitat des ERK-Signalweges konnte in Western-Blot Analysen mit phospho-spezifischen Antikorpern nicht beobachtet werden. Um neue Funktionen und Interaktionspartner von HTRA1 in regulatorischen Prozessen der Zelle zu identifizieren, wurde eine Proteom-Analyse von SW480 Zellen durchgefuhrt, die in distinkten Zellzyklusphasen synchronisiert waren. Die Ergebnisse der Proteom-Analyse deuten auf Funktionen von HTRA1 in Mikrotubuli-assoziierten Prozessen, dem G2-DNA damage checkpoint, der DNA Replikation bzw. des DNA-Licensing und der Apoptose hin. Des Weiteren wurde fur eine Reihe von Proteinen wie Calpaine, Annexine und MCMs eine bisher unbekannte, Zellzyklus abhangige Regulation beobachtet. Neben anderen potentiellen Interaktoren, wurde das Calcium‑bindende Protein Annexin A1 als bisher unbekanntes HTRA1 Substrat identifiziert. Diese Vermutung konnte in einer Western-Blot Analyse von SW480 Zelllysaten und einem in vitro Enzym-Assay bestatigt werden. Da sowohl fur HTRA1 als auch fur Annexin A1 pro- und anti-apoptotische Funktionen beschrieben wurden, wurde der Effekt von HTRA1 auf die Induktion von Apoptose in SW480 Zellen analysiert. Eine Untersuchung der Zellen mittels Durchflusszytometrie ergab, dass Zellen mit verminderter HTRA1 Menge eine hohere Anzahl sterbender Zellen nach Behandlung mit 5-Fluorurazil aufwiesen, als die anderen Zelllinien. Der induzierte Zelltod war zu einem Teil abhangig von der Aktivitat zellularer Caspasen. Daruber hinaus wurden vier klinisch relevante HTRA1 Mutanten aus CARASIL auf ihre Aktivitat und ihren oligomeren Zustand untersucht. Enzym-Assays zeigten eine verminderte oder fehlende proteolytische Aktivitat aller vier Mutanten. Die analytische Grosenausschlusschromatographie und Crosslink-Experimente zeigten, dass der Verlust der proteolytischen Aktivitat auf einen Assemblierungsdefekt der Mutanten zuruckzufuhren war. Die Ergebnisse dieser in vitro Analyse legen dar, dass auch Mutationen auserhalb der Proteasedomane uber einen Assemblierungsdefekt zu einer Inaktivierung von HTRA1 fuhren konnen. Die Aktivitat einer Mutante (R166H) konnte durch Zugabe eines Peptid-Liganden beispielhaft um 40 % restauriert werden. In der monogenetischen Erkrankung CARASIL stellt HTRA1 ein logisches Ziel proteinbasierter Therapien dar. Zusatzlich wurde die Wiederherstellung der HTRA1 Aktivitat durch Methoden der supramolekularen Chemie einen wichtigen Beitrag fur das neue Feld der Proteinreparatur leisten.