Efectos del estrés oxidativo sobre la excitabilidad de las neuronas piramidales de la corteza motora.

El estres oxidativo y la produccion de especies reactivas de oxigeno (ROS) juegan un papel muy importante en el dano neuronal. Numerosas evidencias apuntan a que contribuyen a la degeneracion neuronal que subyace a muchas enfermedades neurodegenerativas, como son la Esclerosis Lateral Amiotrofica (ELA), la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. No obstante, los mecanismos especificos responsables de la neurodegeneracion no se conocen con exactitud. Este proyecto tiene como finalidad conocer, mediante la tecnica de whole-cell patch-clamp, el impacto del estres oxidativo sobre la excitabilidad neuronal y las propiedades funcionales de membrana. El estudio se realizo en neuronas piramidales de la corteza motora usando rodajas de cerebro de ratas jovenes adultas. La formacion de radicales libres derivados de oxigeno fue inducida mediante la perfusion de la rodaja durante un intervalo de 5 a 30 minutos con un hidroperoxido organico, el hidroperoxido de cumeno (HC), que produce peroxidacion lipidica (LPO). La exposicion de las celulas a HC 10 μM produjo grandes cambios en las propiedades electrofisiologicas de las neuronas, la mayoria de los cuales ya fueron significativos a los 5 minutos tras la aplicacion del oxidante. El potencial de membrana de reposo de las neuronas se despolarizo progresivamente durante la exposicion. La resistencia de la membrana aumento a los 5 minutos de aplicacion del oxidante, para luego disminuir con respecto al control a los 15 y 30 minutos. Como consecuencia de estos cambios en resistencia se encontraron cambios en la reobase que disminuyo a los 5 minutos y, posteriormente, aumento a los 15 y 30 minutos tras la tras la administracion de HC. El voltaje de despolarizacion disminuyo progresivamente durante la aplicacion del HC, sin cambios en el voltaje umbral, y de forma paralela al descenso en el potencial de membrana de reposo. Ademas, la amplitud del potencial de accion disminuyo, mientras que la duracion del potencial aumento, de forma progresiva a lo largo del tiempo cuando se aplico el HC. El efecto del HC sobre las propiedades repetitivas de las neuronas fue heterogeneo. Asi, algunas de las neuronas estudiadas (13/30) perdieron completamente la capacidad de disparar repetitivamente potenciales de accion tras la aplicacion de HC, mientras que otras conservaron el disparo (17/30). Estas ultimas neuronas, sin embargo, disminuyeron de forma progresiva tanto la frecuencia maxima de disparo como la ganancia tras la aplicacion del oxidante, mostrando un rango de trabajo mucho menor. El estres oxidativo, inducido por el HC, produjo importantes cambios en la excitabilidad neuronal de la corteza motora de forma dosis y tiempo dependiente. A concentraciones de 1 μM, concentracion que no produce efecto alguno en otras poblaciones neuronales, el HC produjo el bloqueo de corrientes rectificadoras (sag) y disminuyo la amplitud del potencial de accion y la ganancia de la frecuencia de disparo. No obstante, no se observaron cambios significativos en el resto de parametros fisiologicos. La administracion de HC 100 μM produjo el bloqueo completo de la capacidad de disparar potenciales de accion de forma repetitiva en todas las celulas registradas. El efecto sobre el resto de parametros no fue significativamente diferente al producido por 10 μM. El efecto del HC, es ademas dependiente del tamano neuronal. Asi, las celulas de mayor tamano (estimado mediante su capacitancia celular) son las mas sensibles al estres oxidativo. El gran tamano que presentan las neuronas piramidales y la alta sensibilidad demostrada al estres oxidativo hacen que esta poblacion neuronal sea mucho mas susceptible a la muerte neuronal que otras poblaciones. Con la finalidad de comprobar si todos estos cambios en las propiedades de membrana eran debidos a un efecto directo sobre las neuronas piramidales o eran consecuencia de alteraciones a nivel presinaptico, se estudio el efecto del estres oxidativo sobre las entradas sinapticas. En general, el HC produjo una depresion de las entradas sinapticas, demostrando asi que los cambios funcionales producidos por el estres oxidativo se deben a mecanismos pre y postsinapticos. En particular, el HC disminuyo la amplitud, frecuencia y constante de bajada de las corrientes postsinapticas espontaneas tanto excitadoras (sEPSC) como inhibidoras (sIPSC). Sin embargo, no se observo ningun efecto sobre las corrientes postsinapticas miniatura ni excitadoras (mEPSC) ni inhibidoras (mIPSC). Estos resultados podrian deberse a la accion presinaptica del HC que causaria una disminucion de la liberacion de neurotransmisores dependientes de potencial de accion. La disminucion de las entradas inhibidoras desde las interneuronas premotoras produjo, a su vez, la disminucion de una corriente tonica dependiente de receptores GABAA presente en las neuronas piramidales. Esta disminucion seria la responsable de la hiperexcitabilidad transitoria (aumento de la resistencia junto con una disminucion en reobase) encontrada en las neuronas piramidales durante los primeros minutos tras la administracion del oxidante. Este incremento en la excitabilidad cortical es caracteristica de pacientes con ELA. En general, los efectos producidos por el HC fueron irreversibles. Tan solo cuando el lavado se realizo a los 5 minutos de exposicion al oxidante se restablecio la normalidad en algunos parametros, como la resistencia. Este dato es relevante, porque significa que la eficacia de los Resumen | 5 agentes neuroprotectores dependeria de la etapa en la que se produzca su administracion. Asi, en este estudio se demostro que la preincubacion con el antioxidante melatonina previne la LPO y los cambios electrofisiologicos inducidos por el HC. Nuestros hallazgos permiten proponer a la melatonina como un agente neuroprotector que podria utilizarse como estrategia terapeutica en el tratamiento temprano de enfermedades neurodegenerativas. En conclusion, podemos decir que el estres oxidativo, en gran parte a traves de la LPO, compromete la excitabilidad neuronal a traves de mecanismos pre y postsinapticos, produciendo, entre otros, una hiperexcitabilidad transitoria durante los primeros estadios de la oxidacion que es caracteristica de la ELA. Por lo tanto y asumiendo que el estres oxidativo contribuye al desarrollo de esta patologia, proponemos que la LPO, por un lado alterando la inhibicion cortical (tonica y fasica) y por otro lado afectando directamente la excitabilidad de las neuronas piramidales, conduciria a la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades neurodegenerativas como la ELA.