Methoden zur Untersuchung der Allelfrequenzen und-verteilung im Acetolactat-Synthase (ALS)-Gen bei Target-Site-Resistenzen in Echinochloa crus-galli

Huhnerhirse (Echinochloa crus-galli) gewinnt als Ungras im Maisanbau zunehmend an Bedeutung. Einseitiger Einsatz von ALS-Inhibitoren erzeugt einen Selektionsdruck, der zu vermehrtem Auftreten von Resistenzen fuhrt. Haufig handelt es sich um Target-Site-Resistenzen (TSR) mit Punktmutationen an den Positionen Ala-122, Pro-197 oder Trp-574 des ALS-Gens. Dieses liegt in der hexaploiden Huhnerhirse in drei homologen Varianten vor. Gangige PCR-Verfahren ermoglichen nur eine gemeinsame Analyse aller Genvarianten, wodurch ein groser Teil des Informationsgehalts verloren geht. Fur eine fundierte Aussage mussen die Genvarianten getrennt analysiert werden. Ein methodischer Ansatz war die allel-spezifische PCR. Hierfur wurden DNA-Polymorphismen zwischen den drei ALS-Genvarianten genutzt, um diese separat bei Position 574 hochspezifisch zu amplifizieren und zu sequenzieren. Die schwierige Struktur und geringe Polymorphismen verhinderten den Einsatz der allel-spezifischen PCR an den Positionen 122 und 197. Hier wurden die drei Genvarianten gemeinsam amplifiziert und anschliesend in einem mehrstufigen Ansatz mit Restriktionsenzymen spezifisch verdaut. Nach Separation, Aufreinigung und Reamplifikation der Fragmente wurden die einzelnen Genvarianten durch Pyrosequenzierung analysiert. So konnten an Position Ala-122 in allen ALS-Homologen heterozygote Mutationen nachgewiesen werden, bei Pro-197 und Trp-574 dagegen heterozygote bzw. homozygote Mutationen nur bei ALS3. Durch die Etablierung dieser Methoden konnen nun Resistenzmuster in Populationen von Echinochloa crus-galli detaillierter untersucht und wichtige Daten zu deren Ausbreitungsdynamik gewonnen werden.