慢病毒介导 RNAi 沉默大鼠脊髓神经元 NF-κB p65 基因的观察

目的 构建NFκBp65基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并转染体外培养的大鼠脊髓神经元,观察其沉默效率。方法 针对大鼠NFκBp65基因特异性序列,设计3条NFκBp65siRNA序列及1条阴性对照序列,合成包含各正反义靶序列的互补DNA链,退火形成双链DNA,插入到经BamHI和EcoRI酶切后的pFUGW慢病毒载体中,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定。与慢病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0通过lipofectamine2000共转染至包装细胞293T,经滴度测定后转染体外培养的大鼠脊髓神经元。实验分为5组：阴性对照组、LVNC组、LVshNFκBp651组、LVshNFκBp652组和LVshNFκBp653组,观察转染效率,Westernblotting法检测慢病毒表达载体对神经元NFκBp65基因的沉默效应。结果 测序结果证实合成的寡核苷酸链插入正确,重组载体构建成功,测定病毒滴度为108～9TU/mL,慢病毒重组体能够成功转染大鼠脊髓神经元,转染效率大于90%,与阴性对照组或LVNC组比较,LVshNFκBp651组和LVshNFκBp652组NFκBp65蛋白的表达明显下调（P均〈0.01）,而LVshNFκBp653组无明显下调（P〉0.05）。结论 成功构建了大鼠神经元NFκBp65基因的RNAi慢病毒载体,它可使大鼠脊髓神经元NFκBp65基因表达下调。