MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVIDOS NO AUMENTO DA EXPRESSÃO DE HBF IN VITRO EM UMA SUBPOPULAÇÃO DE CÉLULAS CD34+ DE PACIENTES COM β-TALASSEMIA MAIOR

Pacientes com β-talassemia homozigotica e genotipo β0β0 produzem apenas hemoglobina fetal (HbF) e uma pequena proporcao de hemoglobina A2. No entanto, na medula ossea desses pacientes foram descritas duas subpopulacoes de eritroblastos, uma com alta producao de HbF (High HbF) e outra com baixa producao de HbF (Low HbF). As celulas High HbF sao provavelmente aquelas que sobrevivem a eritropoiese e dao origem aos globulos vermelhos viaveis. Entretanto, os mecanismos moleculares envolvidos nessa alta producao de HbF ainda nao foram elucidados. Portanto, o objetivo do nosso projeto foi estudar, em cultura de celulas CD34+ de pacientes β0β0, diferenciadas para eritrocitos in vitro, as caracteristicas moleculares das celulas relacionadas a alta producao de HbF (High HbF), frente aquelas com baixa producao de HbF (Low HbF). Para tanto, foi feita a coleta de sangue periferico dos pacientes e foram identificadas as celulas CD34+, essas foram diferenciadas in vitro e isoladas por citometria de fluxo (FACS Aria) de acordo com o conteudo intracelular de HbF. Apos a separacao dos grupos High HbF e Low HbF, as celulas foram avaliadas morfologicamente por microscopia optica, confocal e citometria de imagem. Em seguida, o RNA total foi extraido do pool de celulas isoladas e realizado o ensaio de sequenciamento de RNA (RNAseq), de forma que fosse possivel analisar os transcritos que estavam diferencialmente expressos entre cada um dos grupos. Por fim, validamos os dados de sequenciamento por PCR em tempo real. O isolamento foi realizado no 10°dia de cultivo celular, quando as celulas apresentavam duplo perfil de marcacao para anticorpos anti-transferrina (CD71) e anti-glicoforina (CD235), a intensidade media de fluorescencia (MIF) dos marcadores foi de 1058 e 1365 para CD71 em grupos de controle saudavel e β-talassemia, respectivamente, e para CD235 foi de 430 em controles e 516 em β0β0. As celulas apresentavam-se em estagio intermediario de maturacao. Apos o isolamento das subpopulacoes de celulas de High HbF e Low HbF, a microscopia confocal mostrou uma clara diferenca nos niveis de HbF intracelular das celulas analisadas, confirmando que o isolamento por citometria havia ocorrido conforme o esperado. Ao analisarmos, por citometria de imagem, as subpopulacoes das celulas isoladas, obtivemos um MIF de 7,8 × 105 para celulas High HbF e 1,7 × 105 para celulas Low HbF. Quando fizemos as analises para single cell, esses valores variaram de 2,2 × 105 para as celulas Low HbF e 1,9 × 106 de MIF para as celulas High HbF. Apos todos os dados gerados pelo RNAseq serem filtrados, obtivemos uma lista de 16 genes enriquecidos e diferencialmente expressos entre celulas High HbF e Low HbF. A partir desses genes, foi possivel identificar dois que aparentemente estavam associados ao aumento da producao de hemoglobina fetal, os genes SMARCA1 e LIN28B. O gene LIN28B codifica uma proteina de ligacao ao RNA, que e descrita como um possivel regulador dos niveis de HbF durante o desenvolvimento fetal, por aumentar a expressao de gama globina. Ja o gene SMARCA1 contribui para o complexo de remodelacao da cromatina durante o processo de transcricao e pode estar envolvido com os niveis de expressao de HbF. Esses resultados nao apenas contribuem para um melhor entendimento dos mecanismos de regulacao genica envolvidos na producao de HbF, mas indicam uma potencial nova abordagem terapeutica para aumentar a producao de HbF em hemoglobinopatias.