VEGF Regulation durch Activin A im humanen hepatozellulären Karzinom VEGF regulation through activin A in human hepatocellular carcinoma

Introduction: Upregulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) is known to play a critical role in hepatocellular tumour biology. In an attempt to identify factors responsible for VEGF induction in human hepatocellular carcinoma (HCC), we evaluated the effects of activin A on VEGF gene expression. Methods: Expression of VEGF, activin A and its receptors was analyzed in vivo by immunohistochem- istry and in vitro by polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Activin A effects on VEGF gene regulation were analysed by ELISA and proliferation assays. VEGF promoter analysis and gel shift assays were performed to define minimal promoter requirements and potential transcription factors. Results: Expression of activin A., the four receptors (ActR-I, ActR-IB, ActR-II and ActR-IIB) and VEGF was demonstrated by immunohistochemistry in 9/9 HCC's. In vitro the expression of VEGF and the activin A/receptor system could be confirmed by ELISA and RT-PCR in three HCC cell lines. Incubation of HCC cells with activin A lead to a significant time and dose de- pendent growth inhibition after 72 hours. The VEGF expression was significantly stimulated with a peak after 96 hours. Transient transfections, deletional and gel shift assays demonstrated activin A dependent stimulation of the VEGF promoter through Sp1 dependent activation of the -85 to -50 promoter region of the VEGF promoter. Conclusion: For the first time it could be demonstrated on a molecular basis, that activin A indirectly stimulates angiogenesis in human HCC through induction of VEGF. This autocrine/ paracrine loop serves as a potential target for a therapeutical antiangiogenic approach. Einleitung Die Stimulation des vaskularen endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) spielt eine wichtige Rolle in der Tumorbiologie des hepatozellularen Karzinoms (HCC). Um mogliche Faktoren, die zu einer VEGF Induktion im HCC fuhren, zu identifizieren, wurden die Effekte von Activin A, ein Zytokin aus der TGF-β-Familie, auf die VEGF Genexpression im HCC untersucht. Material und Methoden: Die in vivo Analyse der Expression von Activin A und VEGF und der Rezeptoren erfolgte an 9 HCC- Biopsaten mittels Immunhistochemie, sowie in vitro in drei HCC-Zelllinien mittels ELISA und RT-PCR. Die Effekte von Activin A auf Zellwachstum und VEGF Proteinexpression wurden durch Proliferationsassays und ELISA untersucht. Die Activin A Responsivitat der VEGF Gentranskription wurde in Transaktivierungs- und Gel-Shift-Assays (EMSA's) des VEGF Promotors analysiert und der Activin A sensible Bereich durch transiente Transfektionen mit 5'Deletionskonstrukten eingegrenzt. Ergebnisse: Activin A, die vier Rezeptoren (ActR-I, ActR-IB, ActR-II und ActR-IIB) und VEGF konnten immunhistochemisch in allen untersuchten HCC's uber Tumorzellen nachgewiesen werden. In vitro konnte die Expression von VEGF und des Activin A/Rezeptorsystems mittels ELISA und RT-PCR bestatigt werden. Die Inkubation der HCC-Zelllinien mit Activin A fuhrte zu einer signifi- kanten Wachstumsinhibition nach 72 Stunden und zu einer zeit- und dosisabhangigen Stimulation der VEGF Proteinkonzentration mit maximaler Stimulation nach 96 Stunden. Transiente Transfek-