Herstellung und Anwendung von hochkomplexen Peptidbibliotheken

Die Fahigkeit von Proteinen physische Interaktionen mit anderen Proteinen und Biomolekulen einzugehen bildet eine wichtige Grundlage ihrer Funktion im menschlichen Organismus. Storungen in diesen Interaktionen konnen Fehlfunktionen in den beteiligten Signal- oder Stoffwechselwegen hervorrufen und letztlich zu Krankheit und Tod fuhren. Fur das molekulare Verstandnis der beteiligten Prozesse ist es wichtig, die Protein-Interaktionen im Detail zu studieren. Neben genetischen, zellbiologischen und komplexen biochemischen Ansatzen gewinnen Array-basierte Verfahren zur systematischen Suche nach Protein-Interaktionspartnern zunehmend an Bedeutung. Die Nutzung von entsprechenden Protein- und Peptid-Arrays wird derzeit aber noch durch deren schlechte Verfugbarkeit erschwert. Peptidarrays, die sich hervorragend fur die Hochdurchsatzsuche nach Agonisten und Antagonisten und somit fur die Entwicklung von peptidischen Wirkstoffen eignen, werden bis dato kommerziell nach dem etablierten SPOT-Verfahren mit Arraydichten von 25 Peptiden pro cm2 gefertigt. Um die Komplexitat der Peptidarrays zu steigern und die hohen Kosten der Peptidsynthese zu senken, wurde in der Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg/Deutschland) eine neue Synthesetechnik entwickelt. Dieses Verfahren beruht auf Aminosaurepartikeln, in deren Matrix die Aminosauren fur die kombinatorische Peptidsynthese eingebettet sind. Die Partikel werden mit einem modifizierten Laserdrucker oder durch Einsatz von speziellen Mikrochips an die Syntheseorte auf dem Array gebracht. Anschliesend wird der Trager erhitzt, wodurch sich die Partikelmatrix verflussigt und die Kopplung der Aminosauren an den Trager initiiert wird. Durch wiederholtes Ablagern, Koppeln und Waschen konnen die gewunschten Peptidbibliotheken kombinatorisch erzeugt werden. Die Methode ubertrifft den Stand der Technik bezuglich ihrer Komplexitat mit bis zu 400 Peptidspots/cm2 fur den Laserdrucker und mit 10.000 - 40.000 Peptidspots/cm2 fur den Mikrochip um ein Vielfaches und das bei deutlich geringeren Herstellungskosten. Vor der Etablierung der Synthesemethode und der breiten Nutzung der „gedruckten“ Peptidarrays sollten diese zunachst im Rahmen meiner Arbeit umfassend charakterisiert werden. In biologischen, medizinischen und biotechnologischen Modellanwendungen sollte zudem die Verwendung der Peptidarrays als funktionelles Werkzeug getestet werden. In Phosphorylierungsexperimenten wurden Substratpeptide unterschiedlicher Kinasen, darunter die cAMP-abhangigen Proteinkinase (PKA) und c-Src, kombinatorisch synthetisiert und auf dem Array phosphoryliert. In Ubereinstimmung mit der Literatur wurde durch die PKA primar die Serin-Seitenkette phosphoryliert, wenn diese in der Erkennungssequenz RRXS (X = variable Aminosaure) vorlag. Durch diesen Versuch wurde die Anwendbarkeit der mit Hilfe von festen Aminosaurepartikeln synthetisierten Peptidarrays zur Identifizierung von spezifischen Proteinkinasesubstraten belegt. Die Experimente zur Suche nach katalytisch aktiven Peptiden beruhten auf Studien von Berkessel et al. die komplexbildende Peptide und Peptidderivate identifiziert hatten, welche die hydrolytische Spaltung von Phosphorsaureestern katalysieren. Trotz umfangreicher Versuche konnten diese Ergebnisse allerdings nicht auf die von uns synthetisierten Peptidarrays ubertragen werden. Die durch die hydrolytische Spaltung entstehenden gefarbten Reaktionsprodukte konnten nicht eindeutig nachgewiesen und damit eine katalytische Aktivitat der metallhaltigen Peptidderivate nicht belegt werden. In einem weiteren Modellversuch wurde nach metallbindenden Peptiden gesucht, die bspw. in der Nuklearmedizin eingesetzt werden konnen. Viele Radiopharmazeutika enthalten das metastabile 99mTechnetium, das als metallorganischer Komplex an ein bioaktives Molekul zur Erkennung einer Zielstruktur gebunden ist. Um [99mTc(H2O)3(CO)3]+-bindende Peptide zu identifizieren, wurde ein Hexapeptid-Array mit 133.224 individuellen Peptidspots (XAs1As2As3As4X; X= Aminosauregemisch) auf einer chemisch modifizierten Glasplatte (21 x 22 cm2) unter Verwendung des Peptidlaserdruckers hergestellt. Die Peptidbibliothek wurde nach [99mTc(H2O)3(CO)3]+- und - als Kontrolle - nach 99mTcO3+-bindenden Peptiden durchsucht. Mit der Einschrankung, dass in der ersten und letzten Position der identifizierten Hexapeptide noch ein Gemisch von Aminosauren vorliegt und eine abschliesende Verifizierung der Resultate (z.B. HPLC) noch aussteht, wurden Peptidkandidaten bestimmt, die den Technetiumcarbonylkomplex stabil binden. Die Untersuchungen unterstreichen das Potential der „gedruckten“ Peptidarrays als Werkzeug zur Identifizierung von medizinisch relevanten Metall-Peptid- Komplexen. In einem weiteren Projekt wurde die grundsatzliche Realisierbarkeit der kombinatorischen Peptidsynthese auf einem Mikrochip anhand einfacher immunologischer Anwendungen dokumentiert.