Construction and validation of HSV-1 vectors with selective and long-term expression in bladder afferent neurons for gene therapy of neurogenic detrusor overactivity. : A translational approach

Cinquante a 80% des patients atteints d'une lesion medullaire traumatique (LM) presente des d'episodes d'incontinence urinaire lies a une hyperactivite detrusorienne neurogene (HDN). L’HDN est caracterisee par des contractions non inhibees du detrusor pendant la phase de remplissage vesical, qui conduit a une augmentation des pressions detrusoriennes, particulierement lorsque l’HDN est associee a une dyssynergie vesico-sphincterienne. L'objectif principal de la prise en charge de l’HDN est d'obtenir une vidange vesicale reguliere, complete et a basse pression, ainsi que de maintenir la continence urinaire, afin d'ameliorer la qualite de vie des patients et de prevenir les complications uro-nephrologiques dont l’insuffisance renale. La prise en charge actuelle repose sur une pharmacotherapie agissant principalement au niveau de la branche efferente, motrice, du reflexe mictionnel, permettant ainsi un remplissage vesical a basse pression. Le traitement de premiere intention repose sur des antimuscariniques oraux, le plus souvent associes a la realisation d’autosondages pluriquotidiens. En cas d’echec de cette therapeutique, l’injection intradetrusorienne de toxine botulique A est proposee. Cependant, malgre leur efficacite, ces traitements induisent des effets secondaires et souffrent d’un echappement therapeutique, conduisant a un traitement chirurgical de troisieme ligne. La technique de Brindley, qui consiste en une desafferentation des racines posterieures sacrees innervant la vessie associee a une stimulation electrique, a la demande, des racines anterieures est une alternative prometteuse, mais reste peu proposee en raison de la complexite de la procedure chirurgicale requise. L'HDN resulte de l'emergence d'un reflexe spinal anormal medie par une plasticite des afferences vesicales de type-C dans les suites de la LM. Le projet de mon equipe est de realiser une deafferentation vesicale par therapie genique afin d'abolir le reflexe de miction spinale alteree. Dans un second temps, la miction sera declenchee par une stimulation electrique a la demande, des neurones efferents de la vessie. Mon travail de these consistait a developper les outils necessaires a une telle desafferentation moleculaire. En consequence, j'ai construit des vecteurs defectifs HSV-1 delivrant comme transgene therapeutique la chaine legere d’un toxine botulique (BoNT-LC), sous le controle du promoteur du gene codant pour la proteine liee au gene de la calcitonine (hCGRP), permettant une expression selective au sein des neurones sensoriels. La cassette de transcription a ete inseree dans le locus LAT du genome HSV-1, la seule region du genome du virus qui reste active sur le plan transcriptionnel pendant une infection latente. Ces vecteurs ont ete evalues (i) in vitro, sur des lignees cellulaires d'origine neurale et sur des cultures primaires de neurones sensoriels embryonnaires et adultes de rats, ainsi que sur des cultures primaires de neurones sensoriels et sympathiques humains adultes, (ii) ex vivo, sur des cultures organotypiques de ganglions sensoriels, sympathiques et parasympathiques de rats adultes, et (iii) in vivo, post inoculation au niveau du coussinet plantaire de rats adultes. Nos resultats indiquent que (i) les vecteurs expriment des BoNT-LC fonctionnelles, clivant ainsi les proteines SNARE post infection de cultures primaires de neurones sensoriels de rats et d’etre humain, et inhibant la liberation du neuromediateur CGRP dans les neurones sensoriels de rat, (ii) la selectivite d’expression de ces vecteurs dans des neurones sensoriels humains, par rapport aux neurones sympathiques humains, et (iii) une expression transgenique prolongee in-vivo au sein de ganglions sensoriels (DRG), au moins pour trois mois, apres injection. Par consequent, ces vecteurs semblent presenter les trois principales specifications requises pour le developpement d’une future strategie de therapie genique visant a traiter l’HDN.