Molekulare und phänotypische Charakterisierung von Drosophila melanogaster Synapsin Mutanten und In-vivo Calcium Imaging

Durch genaue Kartierung der Defizienzen in den Mutanten konnten bislang unbekannte regulatorische Elemente des Synapsin Gens identifiziert werden. Mit dieser Information sollte es moglich sein, einen Synapsin-„Rescue“ Vektor zu konstruieren, der nach Transformation in die Nullmutante den wildtypischen Phanotyp wiederherstellt. Beim Vergleich der im Rahmen des Berkeley Drosophila Genom Projekt veroffentlichten Sequenz des Synapsin Gens mit vor sieben Jahren publizierten Sequenzdaten fielen Diskrepanzen sowohl in der genomischen Sequenz als auch in der cDNA auf. Um zu klaren, ob es sich hier um Artefakte, Polymorphismen oder systematische Modifikationen handelt, wurde der entsprechende Bereich von neun an verschiedenen Orten gefangenen Wildtypen genomisch und auf der cDNA Ebene amplifiziert und sequenziert. In allen Fallen wurde die genomische Sequenz des Genomprojekts verifiziert, so dass von einem Sequenzierfehler in der fruheren Sequenz auszugehen ist. Als Folge ergibt sich eine Exon-Intron Struktur, bei der die Spleis-Konsensussequenz (GT-AG Regel) im Intron 4 des Synapsins gewahrt bleibt. Dagegen bestatigten die RT-PCR Sequenzen die fruheren cDNA-Daten, so dass ein A zu G Austausch zwischen der genomischen Sequenz und der cDNA des Proteins aufgedeckt wird. Dieser Austausch fuhrt zu einer Veranderung der in allen bisher bekannten Synapsinen konservierten Zielsequenz der Proteinkinase CaMK I/ IV und PKA, was interessante Fragen zu seiner funktionellen Bedeutung aufwirft. Die Basensubstitution spricht fur ein A-zu-I RNA-Editing auf der Ebene der Ribonukleinsaure. Dieser Vorgang wird durch das Enzym dADAR katalysiert und wurde bereits fur verschiedene neuronale Proteine nachgewiesen. Die fur die Reaktion benotigte doppelstrangige Sekundarstruktur der RNA kann durch die Sequenz der pra-mRNA des Synapsins gebildet werden. Die potentielle „Editing site Complementary Sequence“ (ECS) konnte im Intron 4 in einem Abstand von ca. 90 Basen stromabwarts der Editing-Stelle durch ein Computerprogramm ermittelt werden. Der A zu G Austausch wird in allen Laborwildtypen und allen neu etablierten Stammen, sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien beobachtet. Lediglich in einem cDNA-Gemisch aus Eiern, Embryonen und 1. Larven findet man neben der editierten auch die nicht-editierte Sequenz. Um in spateren Experimenten die Funktion der Phosphorylierung und die Auswirkung der mRNA Editierung ermitteln zu konnen wurden in einem weiteren Versuch die beiden Erkennungsstellen der PKA in der cDNA durch Mutationen modifiziert, so dass Phosphorylierungstests an den Konstrukten durchgefuhrt werden konnen. Zur phanotypischen Charakterisierung der Nullmutante wurde die Defizienz-Linie Syn97 durch extensive Ruckkreuzung in den genetischen Hintergrund des Wildtyps CantonS eingebracht, der als Standard-Kontrollstamm fur Verhaltensexperimente und insbesondere Lernversuche dient. Die Linie Syn97CS wurde im Rahmen einer Kooperation von Mitarbeitern des Lehrstuhls in verschiedenen Verhaltenstests und Lernparadigmen auf phanotypische Veranderungen uberpruft. Dabei fanden sich mehrere Verhaltensunterschiede zum Wildtyp, die vermutlich auf geringfugigen Modifikationen in komplexen neuronalen Netzwerken beruhen. In operanten Lernparadigmen konnte ein Einfluss der Synapsin-Elimination auf den Lernerfolg detektiert werden. Dabei trat die Reduktion des Lernindex bereits im dritten Larvenstadien auf und setzte sich in der adulten Fliege fort. Der Einfluss des Fehlens des Synapsins auf Lernprozesse in Drosophila steht im Einklang mit Befunden aus Knock-out Mausen fur SynI + II. Im reduzierten Courtship Index der Syn97CS Mannchen offenbart sich ein konkreter Hinweis auf eine verringerte Darwin’sche Fitness der Synapsin-Nullmutante. Die Gesamtheit der in der Synapsin-Nullmutante entdeckten Phanotypen konnte den hohen Konservierungsgrad des Proteins zwischen Vertebraten und Invertebraten erklaren. In einem weiteren Teil-Projekt konnten Mutationen in die cDNA des Calciumsensor Cameleon 2.0 Proteins eingebracht werden, um so die verbesserte Version Cam 2.1 zu erhalten. Daraufhin wurden mehrere transgene UAS-Cam 2.1 Linien hergestellt, die bei der Kreuzung mit verfugbaren Gal4 Linien den Calciumsensor fur eine Expression in definierten Neuronenpopulationen von Drosophila zuganglich machen. In weiterfuhrenden Arbeiten konnte die Funktionalitat des Fusionsproteins uberpruft werden und somit die ersten Schritte hin zur Anwendung der in-vivo Calcium Imaging Methode am Lehrstuhl durchgefuhrt werden.