Regulación simbiótica de la expresión del sistema hidrogenasa por NifA en R. leguminosarum bv. viciae

Las proteinas que intervienen en la sintesis de la hidrogenasa [Fe Ni] de R.leguminosarum bv.viciae estan codificadas por una agrupacion de 18 genes estrechamente ligados en el plasmido simbiotico y orientados en el mismo sentido. Esta agrupacion esta formada por tres unidades transcripcionales, dos de las cuales (hupSLCDEF y hupGHIJK) se expresan exclusivamente en simbiosis. Dentro de la unidad transcripcional hupSLCDEF los genes hupSL codifican para las subunidades estructurales de la hidrogenasa. Dicha unidad se expresa a partir del promotor P1.P1, es un promotor de tipo -24/-12 cuya expresion es dependiente de RpoN, de IHF y del activador transcripcional NifA. La activacion dependiente de NifA de P1, fue corroborada en el fondo genetico de K.pneumoniae mediante experimentos de inhibicion de la nitrogenasa por multiples copias de P1, y en el fondo de R.etli utilizando mutantes nifA en simbiosis con judias (Phaseolus vulgaris L.). La activacion de P1, por NifA depende de un elemento en cis localizado entre las posiciones -170/-142. Esta region no contiene UAS consenso de union a NifA. Mediante analisis de delecion, mutagenesis dirigida y aleatoria de los nucleotidos de esta region se demostro que la secuencia que contiene tres semicajas consenso ACAA-N5-ACAA-N12-TTGT era responsable de la union de NifA y de la activacion del promotor. En funcion de estos resultados se propone un modelo cooperativo de activacion de P1 por NifA en el que las proteinas interaccionan directamente con el ADN a traves de las semicajas y facilitan la acumulacion del regulador en el promotor por interaccion proteina-proteina. La unidad transcripcional hupGHIJK, que codifica para proteinas accesorias en la sintesis de una hidrogenasa activa, se expresa al menos desde un promotor P3 de tipo -24/-12 activado inespecificamente en simbiosis con guisantes por NifA. La activacion de P3 por NifA es dependiente de RpoN e independiente de IHF, asi como de elementos en cis localizados delante del promotor. Se propone que NifA interacciona en este promotor directamente con el complejo RpoN-ARN polimerasa. La inespecificidad de P3 permite su activacion por activadores heterologos como NtrC. Ensayos de delecion de P3 demostraron un efecto represor de su activacion por secuencias repetidas de As y Ts. La importancia del activador transcripcional NifA nos llevo a realizar un estudio de su expresion en R. leguminosarum. La organizacion genica de la region nifA se determino mediante analisis de hibridacion y secuenciacion. Esta region incluye los genes nifH orf7lorf79 fixW2 orfW fixABC fixX nifA nifB El analisis de expresion identifico dos promotores funcionales. El promotor PfixW2, localizado delante del operon orf7l orf79 fixW2, es de tipo -24/-12, su expresion simbiotica depende de NifA y contiene UAS canonicas de union a este regulador. El promotor PnifA, localizado delante del gen nifA, se expresa eficientemente en vida libre y pobremente en simbiosis. Se propone que el gen nifA se expresa constitutivamente en vida libre desde PnifA en ausencia de regulador o inducido por un regulador desconocido y en simbiosis su transcripcion se autoregula por NifA desde el promotor PfixW2.