Deciphering molecular mechanisms of unusual variants in Usher Syndrome

Le syndrome de Usher (USH) est une maladie transmise selon le mode autosomique recessif caracterisee par l’association d’une surdite congenitale (HL) et d’une retinite pigmentaire (RP), et dans certains cas, d’une areflexie vestibulaire. Une heterogeneite clinique et genetique est reconnue. Environ 10 % des cas USH restent non resolus apres analyse moleculaire exhaustive des differents genes. Ces cas incluent les patients qui ne portent aucune mutation dans un des genes USH connus ainsi que les patients porteurs d’une seule mutation dans un gene USH. Au cours de cette these, nous nous sommes interesses a l’etude des patients porteurs d’une seule mutation dans les genes USH2A et PCDH15.Dans la premiere partie de la these, nous avons analyse une cohorte de patients avec un phenotype USH2A bien defini : 5 patients pour lesquels une seule mutation a l’etat heterozygote avait ete identifiee dans le gene USH2A et un patient porteur d’un variant silencieux en trans d’une mutation non-sens.Pour les 5 patients, nous avons emis l’hypothese que la seconde mutation, restant a etre identifiee, pourrait se trouver dans des regions introniques profondes. Pour cela, nous avons developpe une approche de sequencage a haut debit (NGS) de l’ADN pour identifier les variants introniques profonds dans le gene USH2A et evaluer leurs consequences sur l’epissage. Comme preuve de concept et pour valider l’approche, y compris le pipeline bio-informatique et l’evaluation des outils de prediction de l’epissage, nous avons analyse un patient porteur d’un pseudoexon (PE) connu dans le gene USH2A. Ensuite, les 5 patients ont ete etudies en utilisant le pipeline defini, ce qui a conduit a l’identification de 3 nouveaux variants introniques profonds chez 4 d’entre eux. Tous les variants ont ete predits comme pouvant avoir un impact sur l’epissage et aboutir a l’insertion de PE. Ces predictions ont ete validees par les essais minigenes. Grâce a cette etude, nous presentons une strategie innovante pour identifier les mutations introniques profondes, lorsque l’analyse des transcrits n’est pas possible. Par ailleurs, le pipeline bio-informatique developpe fonctionne independamment de la taille du gene analyse, ce qui permet l’application possible de cette approche a n’importe quel gene. Par ailleurs, un oligonucleotide antisens de type morpholino (AMO) a ete evalue in vitro afin de retablir l’alteration d’epissage induite par une des mutations identifiees. Les resultats ont montre un taux d’exclusion eleve du transcrit aberrant et suggerent une application possible en therapie moleculaire. Nous avons ensuite effectue des etudes sur le variant USH2A c.1377T>A, un variant silencieux afin d’evaluer son effet sur l’epissage. L’analyse de l’ARN issu de cellules nasales du patient a montre que ce variant conduit au saut de l’exon 8 dans les transcrits USH2A. Ceci a ete confirme par un essai minigene. En outre, des etudes preliminaires ont ete realisees en utilisant des outils de predictions et des essais minigenes pour evaluer l’implication des elements cis-regulateurs dans le defaut d’epissage observe chez le patient. Dans la deuxieme partie de la these, nous avons analyse une patiente USH1, pour laquelle une seule mutation avait ete identifiee dans le gene PCDH15. Dans ce cas, nous avons combine la culture des cellules epitheliales nasales avec l’analyse des transcrits PCDH15. Celle-ci a ete realisee par sequencage de cinq RT-PCR chevauchantes. Grâce a cette analyse, nous avons reussi a delimiter une region d’interet dans le transcrit, dont l’amplification a echoue exclusivement pour l’allele porteur de la mutation non identifiee. D’autres analyses ont ete effectuees dans la region genomique correspondante par capture ciblee couplee au sequencage NGS et LongRange PCR suivi de sequencage Sanger. Cependant, aucun variant candidat n’a ete identifie a ce jour. Nous suggerons l’implication de mecanismes moleculaires complexes qui restent a etre caracterises.