Human intestinal acyl-CoA synthetase 5 is sensitive to the inhibitor triacsin C

瞄准：调查(ACSL5 ) 人的 acyl-CoA 合成酶 5 是否对 ACSL 禁止者 triacsin C 敏感。方法：从象人的 ACSL5 一样的老鼠的 ACSL isoforms ACSL1 和 ACSL5 被克隆并且 recombinantly 表示了酶为 6xHis 标签。Ni2+ 亲密关系净化了 recombinant 酶是在 pH 的 assayed 7.5 或 pH 9.5 当面或 triacsin C 的缺席。另外， ACSL5 transfected CaCo2 房间和肠的人的 mucosa 被监视。在细胞的系统的 ACSL5 表示用西方的污点和 immunofluorescence 被验证。ACSL 试金混合包括了 TrisHCl (pH 7.4 ) ， ATP， CoA， EDTA， DTT， MgCl2，[9,10-3H ] 十六酸酸，和三重氢核 X-100。200 L 反应与 solubilized，净化的 recombinant 蛋白质或细胞的 lysates 的增加被开始。反应与施舍媒介在孵化的 10， 30 或 60 min 以后被终止。结果：可溶的 recombinant ACSL 蛋白质的表示与 isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside 在孵化以后被发现，在 ultracentrifugation 以后，这些进一步被净化与 Ni2+ 亲密关系层析接近同质。Triacsin C 有选择地并且强烈在 pH 禁止了 recombinant 人 ACSL5 蛋白质 7.5 并且 pH 9.5，以及 recombinant 老鼠 ACSL1 (敏感控制) ，然而并非 recombinant 老鼠 ACSL5 (感觉迟钝的控制) 。为人的 ACSL5 的 IC50 是大约 10 mol/L。禁止的 triacsin C 效果在不同孵化时间(10， 30 和 60 min ) 是类似的并且没被 6xHis 标签的 N 终端或 C 终端地点修改。为了在细胞的环境，稳定的人的 ACSL5 CaCo2 transfectants 和机械地把的正常评估 ACSL5 敏感到 triacsin C，有 ACSL5 的高生理的表示的人的肠的 mucosa 被分析。在两个模型， ACSL5 山峰活动在 pH 被发现 7.5 并且 pH 9.5，相应于 recombinant 人 ACSL5 的性质蛋白质。面对 triacsin C (25 mol/L ) ，全部的 ACSL 活动戏剧性地在人的 ACSL5 transfectants 以及在 ACSL5 富有的人的肠的 mucosa 被减少。结论：数据强烈显示人的 ACSL5 对 triacsin C 敏感并且不补偿 C 敏感的 ACSL isoforms 另外的 tri