麦芽糖诱导海藻糖合成酶基因在 B.subtilis WB800n中的表达

运用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖诱导型启动子调控元件，构建得到麦芽糖诱导海藻糖合成酶的安全表达系统，使其制备的海藻糖能够广泛应用于食品医疗行业。以来源于恶臭假单胞杆菌KT2440（ Pseudomonas putida KT2440）的海藻糖合成酶基因TreS为报告基因，以cre序列定点突变（CG碱基突变为AT碱基）优化后的麦芽糖诱导型的枯草芽孢杆菌操纵元启动子 Pglv 为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒PHT01为载体骨架，通过 BamH Ⅰ和 Aat Ⅱ限制酶酶切替换，构建得到高效表达载体Pglv-PHT01-TreS，将质粒电转化到 B.subtilis WB800n并验证其表达效果。成功构建了海藻糖合成酶高效表达质粒Pglv-PHT01-TreS，并实现了该重组质粒在 B.subtilis WB800n中的表达。利用基础发酵培养基优化发酵条件验证结果表明，菌体生长到发酵液吸光值OD 600 达到1.2时加入终质量分数4.5%的麦芽糖，37℃诱导18 h后胞内的海藻糖合成酶的粗酶活力达到18.9 U/mL。为了提高海藻糖合成酶的表达量，还构建了通过单交叉互换方法敲除了α-淀粉酶基因amyE的重组菌株 B.subtilis WB800n（ ΔamyE ），减少了胞外α-淀粉酶对麦芽糖的降解成葡萄糖，提高了麦芽糖的诱导表达效果以及减少葡萄糖的反馈抑制，表达质粒在麦芽糖诱导条件下在该重组菌中海藻糖合成酶酶活提高到了29.2 U/mL。首次成功实现了麦芽糖诱导海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达，为获得制备安全高效的海藻糖合成酶表达系统奠定了基础。