Design, Synthese und Analyse von Inhibitoren für die humane Blutgruppe-B-spezifische Galactosyltransferase

Die Suche nach spezifischen Inhibitoren fur Glycosyltransferasen ist bis heute anspruchsvoll. Dies liegt einerseits an der komplexen Reaktion, die von den Enzymen katalysiert wird und wird andererseits durch die Lage der Enzymklasse erschwert, die als Transmembranproteine vorrangig im Golgi lokalisiert sind. Zusatzlich verwenden verschiedene GTs identische Donorsubstrate, so dass dadurch fur die spezifische Inhibition eines einzigen Zielenzyms viele Faktoren berucksichtigt werden mussen. In der vorliegenden Arbeit konnte die Uberprufung eines innovativen Konzepts zur spezifischen Inhibition einer einzelnen Glycosyltransferase erfolgreich an dem Modellsystem der humanen Blutgruppe-B-spezifischen Galactosyltransferase durchgefuhrt werden. Zwei 9-N-Pentityl Harnsaurederivate (1 und 2), die sich in computergestutzten Experimenten als vielversprechende Kandidaten fur den Ersatz des UDPs im Donorsubstrat UDP-Gal herausstellten, wurden erfolgreich synthetisiert und anschliesend analysiert. Die Bindungseigenschaften der UDP Mimetika konnte durch SPR-Studien und STD-NMR Experimente charakterisiert und zudem ein Bindungsepitop fur das Linkerfragment der Mimetika erstellt werden. Ihre inhibitorische Wirkung gegenuber GTB konnte in kompetitiven STD NMR Experimenten und mit Hilfe eines radiochemischen Inhibitionsassays nachgewiesen werden. Dabei wurde festgestellt, dass 1 GTB um einen Faktor von 1.5 starker inhibiert als 2, so dass sich die inhibitorischen Konstanten beider Verbindungen in einer ahnlichen Grosenordnung bewegen. Die UDP Mimetika sind in der Lage, den energiereichen und ionischen Pyrophosphatteil des Donorsubstrats zu ersetzen, wobei bei Anwesenheit von Mg2+ als bivalentes Kation eine zu UDP vergleichbare Bindungsaffinitat erhalten wird. Die Ergebnisse resultierten in einer Erweiterung der UDP-Mimetika zu den UDP-Gal Mimetika 3 und 4 in silico, wobei 3 auf Grund eines effizienteren synthetischen Zugangs fur die Darstellung ausgewahlt wurde. Die Bindungseigenschaften von 3 gegenuber GTB wurden mit Hilfe von SPR und STD NMR Experimenten untersucht. Auch hier konnte ein Bindungsepitop mittels STD NMR Spektroskopie erstellt werden. Die Inhibition von GTB durch 3 wurde anhand von einer kompetitiven STD Titration und eines radiochemischen Enzymassays bestimmt, wobei sich zeigte, dass 3 GTB um einen Faktor von knapp 5 (STD NMR) starker inhibiert als 2, von dem sich 3 ableitet. Die drei neuen Inhibitoren 1, 2 und 3 wurden auf ihr Inhibitionspotenzial gegenuber der Glycosyltransferase GTA analysiert. Fur dieses Vorhaben wurde ein neuer NMR basierter Inhibitionsassay entwickelt, der sich auf die Progresskurvenanalyse der Enzymreaktion stutzt. Dabei konnte erfolgreich gezeigt werden, dass 1 und 2 auch GTA inhibieren. Dieses Enzym nutzt, wie GTB, ein UDP-aktiviertes Donorsubstrat. Wahrend die UDP-Mimetika sich scheinbar auch fur andere GTs nutzen lassen, die UDP-aktivierte Zucker ubertragen, konnte bei Anwesenheit von 3 keine messbare Inhibition von GTA festgestellt werden. Dies weist darauf hin, dass die Spezifitat in 3 im Vergleich zu 1 und 2 so weit erhoht ist, dass mit dieser Verbindung GTs, die keine D-Galactose ubertragen, erfolgreich diskriminiert werden. Somit ist die Darstellung eines Inhibitors, der spezifisch eine Klasse an GTs, die Galactosyltransferasen, inhibiert, gelungen. Um nun spezifisch nicht nur Galactosyltransferasen, sondern gezielt nur GTB zu hemmen, wurden erste in silico Untersuchungen und Synthesen durchgefuhrt, um die Spezifitat durch die Einbindung des Akzeptorsubstrats weiter zu erhohen. Durch die Verwendung einer Etherbindung zwischen der O6-Position der D-Galactoseeinheit des donorsubstratanalogen Inhibitors und der O3-Position des D-Galactoserestes des Akzeptorsubstrats sollte die Bindungstasche fur beide Substrate von GTB besetzt werden. Fur dieses Vorhaben wurde eine Synthesestrategie erstellt und die Monosaccharidderivate fur die Darstellung des Kohlenhydratteils des bisubstratanalogen Inhibitors erfolgreich dargestellt. Finding suitable inhibitors for one specific glycosyltransferase (GT) is still challenging since the three-dimensional structures of only a few GTs have been solved. Additionally, the search for enzyme specific inhibitors is complicated because a GT class transfers the same carbohydrate residue to an acceptor substrate and they always use the identical donor substrate. Depending on the enzyme, often a bivalent cation is used for catalysis. Here, a new concept for the development of specific inhibitors for glycosyltransferases is presented using the human blood group B galactosyltransferase (GTB) as a model system. Two uric acid derivatives (1 and 2), both exhibiting a pentityl moiety at N-9, were designed as mimics of the UDP part of the donor substrate UDP-Gal using molecular modeling. These compounds were synthesized and subsequently analyzed with a strong focus on the inhibitory potential against GTB. The binding affinity of the UDP mimics was determined by surface plasmon resonance (SPR) and saturation transfer difference (STD) NMR experiments resulting in KD values in the hundred micromolar and low millimolar range. The inhibitory activity of 1 and 2 was characterized by competitive STD NMR experiments using UDP as natural substrate analog and by a radiochemical enzyme inhibition assay competing against UDP-Gal. In these experiments it was observed that both 1 and 2 are able to inhibit GTB, while 1 was slightly more potent than 2. It could be shown that 9-N-pentityl uric acid derivatives could serve as UDP mimics and are able to replace the ionic pyrophosphate fragment of the donor substrate. In the presence of Mg2+ a binding affinity equivalent to UDP was observed. Extension of the UDP mimics to a UDP-Gal mimic using in silico experiments resulted in the synthesis and analysis of a D-galactopyranosyl uric acid conjugate derived from 2. This compound exhibits an α-D-galactopyranosyl residue attached to the pentityl fragment. Using SPR, STD NMR experiments and a radiochemical enzyme assay the dissociation constant KD and the inhibitory constant KI of 3 could be determined and improved by a factor of almost 5 (STD NMR) compared to 2. To determine the inhibitory potential of these inhibitors against different GTs that use UDP activated sugars as donor substrates, a novel inhibition assay was developed. This enzyme inhibition assay uses progress curve analysis derived from tracking the enzymatic reaction by NMR. It could be shown that both UDP mimics 1 and 2 were able to inhibit GTA. However, no decrease of the enzymatic activity of GTA was observed in the presence of 3. This indicates that the specificity of 3 compared to 1 and 2 is increased by the α-D-galactopyranoside fragment present in the UDP-Gal mimic 3 since GTA uses UDP-GalNAc as donor substrate. Thus, an inhibitor for a class of enzymes, in this case addressing galactosyltransferases, was successfully developed. The search for an inhibitor that only inhibits GTB was extended to also involve the acceptor substrate to further increase the specificity of the inhibitor. In computational studies it could be shown that the attachment of a β-D-galactopyranosyl moiety to the O6 position of the galactoside residue of 3 could enhance the specificity of the inhibitory molecule. Consequently, a synthetic strategy was developed and the monosaccharides derivatives that are needed for the synthesis of the carbohydrate fragment of a bisubstrate analogous inhibitor were successfully synthesized.