Contribución al estudio epidemiológico de la brucelosis bovina en la Comunidad Autónoma de Galicia: investigación y aplicabilidad de nuevas técnicas diagnósticas

En las fases finales de la erradicacion de la brucelosis bovina, como es el caso de Galicia, se prioriza la deteccion temprana de los focos y la discriminacion de las falsas reacciones negativas y positivas segun que los animales procedan de focos activos de la enfermedad o de zona libres. Por tanto, el uso del test de diagnostico mas adecuado para cada situacion epidemiologica puede suponer una reduccion del periodo de erradicacion junto con un descenso de los costes de los programas sanitarios. Para que la eleccion de los test sea adecuada y se manifieste el potencial de cada uno de ellos en situaciones determinadas es imprescindible que los laboratorios de diagnostico de rutina garanticen un comportamiento optimo de cada uno de ellos en sus condiciones de trabajo. La herramienta mas adecuada para este fin lo constituye la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005. En este estudio se evaluaron diferentes test utilizados habitualmente en el diagnostico serologico de la brucelosis bovina: aglutinacion en microplaca con rosa de bengala, aglutinacion en microplaca con rosa de Bengala y fijacion de complemento utilizados en serie, dos ELISAs indirectos, y un ELISA competicion. Esta evaluacion incluyo un protocolo de verificacion interna segun la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005, una extension de la validacion aplicando un criterio de comparacion absoluto, una extension de la validacion aplicando un criterio de comparacion relativo y una evaluacion del uso de los test de ELISA en diferentes situaciones epidemiologicas. En ambas extensiones de la validacion se estimaron los parametros de rendimiento mas habituales de los test de diagnostico como fueron la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos, las razones de verisimilitud, la eficiencia y el indice de rendimiento. En la extension de la validacion relativa se utilizo como test de comparacion la aglutinacion en microplaca con rosa de Bengala y la fijacion de complemento aplicados en serie. Adicionalmente, se estimaron los indices Kappa correspondientes y las curvas ROC para los test de ELISA. Para la extension de la validacion se utilizaron muestras obtenidas durante la realizacion de una campana de saneamiento ganadero en Galicia y se organizaron en siete grupos que representan las diferentes situaciones epidemiologicas que se obsevaron en las fases finales de la erradicacion de la enfermedad: sueros positivos de animales con aislamiento, sueros de animales con conversion del titulo de annticuerpos, sueros positivos de animales sin aislamiento, sueros negativos de animales oficialmente indemnes, sueros negativos acompanantes de infectados, sueros con PA y sueros falsos positivos. En relacion a la aglutinacion en microplaca con rosa de Bengala y para los tres tipos de ELISA se elaboro un protocolo de verificacion interna segun los requisitos de la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005. La verificacion interna incluyo estudios de exactitud y de precision, esta ultima en condiciones de repetibilidad y de repetibilidad intermedia, mediante el uso de estandares de referencia, de estandares internos ajustados a los primeros y de muestras de campo positivas y negativas. Adicionalmente, para los test de ELISA se elaboraron dos tipos de graficos para el seguimiento de la precision en condiciones de repetibilida intermedia. Estos graficos incluyeron la representacion de los valores de los estandares de cada placa (graficos DDD) y de los valores de los controles de las placas agrupados por dias (graficos SDC). En relacion a los test, los valores absolutos y relativos obtenidos en la extension de la validacion pusieron de manifiesto la idoneidad de la aglutinacion en microplaca con rosa de Bengala como test de cribado. En los focos activos de la brucelosis ninguno de los test fue capaz de detectar todos los animales positivos individualmente. Tambien se observo que los test no clasificaban igual a todos los sueros. Por tanto, se recomienda el uso de los ELISAs indirecto y competicion, en paralelo, en los focos activos de la infeccion. Para el ELISA competicion se observaron limitaciones para su uso como test de confirmacion debido a diferencias significativas de su especificidad. Este test, aunque no fue capaz de discriminar las reacciones cruzadas, fue el unico capaz de detectar todos los animales positivos modificando el punto de corte, por lo que se recomienda su uso como test de confirmacion en focos activos de la infeccion en substitucion de la fijacion de complemento. Uno de los ELISAs indirectos presento diferencias significativas en la sensibilidad relativa en relacion a los otros ELISAs y se desaconseja su uso en las campanas de saneamiento ganadero. Sin embargo, con los resultados obtenidos para el otro ELISA indirecto, se considera a este test como el mas adecuado para una posible substitucion de la aglutinacion en microplaca con rosa de Bengala como test de cribado.