DETECÇÃO DE GENES ASSOCIADOS AO INCREMENTO NA PRODUÇÃO DE HBF POR UM NOVO MÉTODO “IN VITRO”

A anemia falciforme e uma doenca hereditaria recessiva causada por uma mutacao em um unico nucleotideo no gene da beta globina. Esta mutacao provoca uma alteracao estrutural na qual o acido glutâmico e substituido por uma valina acarretando na falcizacao das hemacias quando desoxigenadas. Alguns farmacos com acao hipometilante sao capazes de induzir a expressao de gama globina atraves da inibicao da metilacao no promotor desse gene. Porem, pouco se sabe a respeito desta regulacao e sobre os genes envolvidos neste processo. Visando compreender esta regulacao, celulas CD34+, de individuos controle, foram tratadas com 1μM de Decitabina no 9°dia de cultura celular para inducao da producao de Hemoglobina Fetal (HbF). Os niveis de expressao dos fatores de transcricao e modificadores da cromatina foram avaliados por meio da plataforma PCR Array (Qiagen™ Germany). Nesse ensaio, foram evidenciados 24 fatores de transcricao diferencialmente expressos, dentre eles, o HNF4α (Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha) regulado positivamente em 26,1 vezes, HNF1α (Hepatocyte Nuclear Factor 1 Homeobox A) 20,0 vezes e o TCF7L2 (Transcription Factor 7 Like 2) 5,9 vezes, em celulas tratadas com Decitabina comparadas ao controle. Selecionamos o gene HNF4α como um candidato para silenciamento utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9 em celulas HUDEP-2 (immortalized human erythroid progenitor) por ser o fator de transcriacao com maior valor diferencial de expressao entre os listados. O HNF4α e descrito como um fator de transcricao que regula a expressao de varios genes hepaticos, podendo atuar no desenvolvimento do figado, rim e intestinos e e expresso em tecido hematopoietico. As celulas HUDEP-2 foram tratadas com Decitabina 50 nM e coletadas apos 72 horas. Os niveis de HbF foram mensurados por citometria de fluxo em triplicas biologicas. A porcentagem de celulas positivas para HbF em HUDEP-2, tratada com Decitabina, foi de 12,27 ± 0,7% n = 3, enquanto nas celulas controle 1,0 ± 0,06% n = 3, p