pcDNA3.1/ASIC1a真核表达载体的构建及其在佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞中的表达

目的通过构建真核表达pcDNA3．1／ASICla质粒，转染佐剂性关节炎（AA）大鼠关节软骨细胞，建立酸敏感通道在关节软骨细胞中过表达的模型，观察ASIClamRNA及其蛋白的相对表达。方法通过PCR扩增目的基因ASICla，并用XbaI和BamHI进行双酶切，同时用这两种酶双酶切质粒pcDNA3．1，将其酶切产物按常规方法连接并转化入大肠杆菌，挑去菌落培养，提取质粒，进行酶切鉴定及测序，然后用Lipofectamine2000转染试剂盒将所构建质粒转染入关节软骨细胞，使用荧光定量PCR、RT．PCR和Westernblot法检测ASIClamRNA和蛋白表达，以鉴定模型建立成功与否。结果①通过对大鼠脑组织RNA的提取及逆转录，获得ASICIa基因，并与载体连接，通过大肠杆菌培养，获得足够多的实验用转染质粒，经酶切鉴定包含目的基因，且酶切条带准确清晰。②Lipofectamine2000细胞转染后，获得稳定阳性克隆细胞，通过对ASICla mRNA及其蛋白相对表达量进行检测，表明转染后细胞mRNA及蛋白量表达均相对上升。结论成功构建了pcDNA3．1／ASICla重组表达载体，并用于观察酸敏感离子通道表达水平对关节软骨细胞代谢的影响。