苹果L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶cDNA克隆及其表达

【目的】了解苹果果实L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP）基因的特性,探索苹果GPP基因表达特性及其与抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）水平的关系。【方法】通过RT-PCR从苹果果实中克隆GPP全长cDNA,分析其序列特征,进行原核表达,制备GPP特异抗体,分析GPP mRNA及其蛋白表达水平与苹果不同组织AsA的关系。【结果】从‘嘎啦’苹果果实中克隆的GPP cDNA（GenBank登录号为FJ752240）包含的最大开放阅读框（open reading frame,ORF）为813 bp,编码270个氨基酸残基,预测分子量为29 kD,该基因与其它植物报道的GPP基因具有较高的相似性,但与肌醇-1-磷酸磷酸酶基因差异较大。构建的pET-32a（＋）-GPP载体在大肠杆菌BL21（E.coli BL21）中异源表达后,获得主要以包涵体存在约50 kD的融合蛋白GPP-His（His约21 kD）。以该蛋白制备抗体,与重组蛋白的Western杂交表明该抗体能与GPP发生特异反应。对苹果可溶性蛋白杂交显示,苹果体内GPP蛋白约33 kD。在苹果不同组织中,GPP mRNA与蛋白质的相对表达水平与AsA含量存在明显的一致性。【结论】以单体形式存在的苹果GPP蛋白具有翻译后修饰特性,且该基因的表达在苹果AsA合成调控中可能起重要作用。