Prilagoditev doze obsevalne terapije pri humanem ploščatoceličnem karcinomu ustnega žrela okuženim s humanim virusom papiloma in vitro in in vivo

Znanstveno izhodisce: Humani virus papiloma (HPV) je eden pomembnejsih povzrociteljev ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela. Opazili so, da HPV-pozitivni ploscatocelicni karcinomi ustnega žrela bolje odgovorijo na socasno radiokemoterapijo s terapevtiki na osnovi platine od HPV-negativnih ploscatocelicnih karcinomov ustnega žrela. To je vzbudilo razmisljanje o znižanju intenzivnosti radioterapije pri teh bolnikih. Pogoj je ohranitev deleža ozdravitev, ki je dosežen s konvencionalnimi dozami obsevanja (frakcionirano obsevanje, skupna doza obsevanja 70 Gy) in sistemskih terapevtikov, namen pa zmanjsanje neželenih stranskih ucinkov zdravljenja. Do sedaj opravljene raziskave kažejo, da so boljsi rezultati zdravljenja HPV-pozitivnih ploscatocelicnih karcinomov ustnega žrela posledica vecje obcutljivosti teh tumorjev na radioterapijo in nekatere sistemske terapevtike, ki se uporabljajo za zdravljenje bolnikov s HPV-pozitivnimi tumorji ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela. Molekularni mehanizmi povecane obcutljivosti HPV-pozitivnih celic ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela na radioterapijo in izbrane sistemske kemoterapevtike na osnovi platine niso popolnoma jasni, verjetno pa temeljijo na slabsem popravilu DNA. Predklinicne raziskave mehanizmov delovanja radioterapije na HPV-pozitivnih tumorskih modelih so redke. Se redkejse so predklinicne raziskave odziva HPV-pozitivnih tumorskih modelov ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela na kombinacijo obsevanja in sistemske kemoterapije s cisplatinom, ki bi omogocale boljse nacrtovanje zdravljenja. Namen in hipoteze: Namen doktorske naloge je bil ugotoviti, za koliko lahko pri HPV-pozitivnih tumorjih (v primerjavi s HPV-negativnimi tumorji) zmanjsamo dozo obsevanja, ne da bi s tem zmanjsali ucinek zdravljenja. Nase hipoteze so bile, da je v kombinaciji s cisplatinom radiosenzitivnost HPV-pozitivnih tumorskih celic ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela in vitro vecja od radiosenzitivnosti HPV-negativnih tumorskih celic ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela; da je radiosenzitivnost HPV-pozitivnih tumorskih celic vecja zaradi zmanjsanega delovanja popravljalnih mehanizmov DNA; ter da se lahko pri HPV-pozitivnih misjih tumorskih modelih ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela enak delež ozdravitve kot pri HPV-negativnih misjih tumorskih modelih doseže z nižjo dozo obsevanja ob socasni terapiji s cisplatinom. Metode: V raziskavah in vitro smo s pomocjo testa klonogenosti dolocili stopnjo obcutljivosti HPV-pozitivne (2A3) in HPV-negativne (FaDu) tumorske celicne linije na obsevanje, terapijo s ciplatinom in kombinacijo obeh. Ovrednotili smo razliko v deležu in casovni dinamiki popravila poskodb DNA med HPV-pozitivnimi in HPV-negativnimi tumorskimi celicami in vitro. Dolocili smo stopnjo eno- in dvoverižnih prelomov DNA (kometni test) in tvorbo žarisc fosforiliranih histonov γH2AX na DNA (ki oznacujejo dvoverižne prelome DNA) po obsevanju, terapiji s ciplatinom in kombinaciji obeh. Obenem smo spremljali tudi pojav posredovanega ucinka sevanja (ang. bystander effect) po obsevanju HPV-pozitivnih in HPV-negativnih celic (ob socasni terapiji s cisplatinom). Dodatno smo preverili se morfologijo celic po obsevanju v kombinaciji s cisplatinom ter ovrednotili delež apoptoticnih in mitoticnih celic. Poleg tega smo s pomocjo pretocne citometrije preverili spremembe v poteku celicnega cikla po terapiji. Isti humani tumorski celicni liniji kot v poskusih in vitro smo uporabili za indukcijo tumorjev na imunsko oslabljenih laboratorijskih misih (SCID). S testom zaostanka v rasti tumorjev smo preverili odziv obeh tumorskih modelov na obsevanje ter na socasno terapijo s cisplatinom. Dolocili smo tudi faktor modificiranja doze obsevanja ob socasni terapiji s cisplatinom pri HPV-pozitivnih tumorjih za dosego enakega ucinka zdravljenja kot pri HPV-negativnih tumorjih s standardnimi dozami. Rezultati: Tako v in vitro poskusih kot tudi na tumorskem modelu in vivo smo pokazali, da so HPV-pozitivne celice oziroma tumorji bolj obcutljivi na samo obsevanje kot HPV-negativne celice in tumorji. Na samo terapijo z nizkimi dozami cisplatina sta bili obe tumorski celicni liniji v raziskavi in vitro enako obcutljivi. Tudi potenciacija ucinka obsevanja z dodajanjem cisplatina je bila in vitro prisotna pri obeh tumorskih celicnih linijah. V raziskavi in vivo je bila ucinkovitost dodanega cisplatina vecja pri HPV-negativnih tumorjih, vendar je bil skupni ucinek se vedno vecji pri HPV-pozitivnih tumorjih. Faktor modificiranja doze, izracunan s primerjavo ucinkovitosti obsevanja oziroma kombinirane terapije glede na HPV status tumorja, je znasal 1,3 oziroma 1,2, kar pomeni, da so HPV-pozitivni tumorji za 30 % bolje odgovorili na radioterapijo ter za 20 % bolje na kombinirano terapijo kot HPV-negativni tumorji. Ugotovili smo, da je prislo pri HPV-pozitivnih celicah po samem obsevanju in po kombinirani terapiji do vecjega deleža dvoverižnih prelomov DNA, ki so se v primerjavi s prelomi pri HPV-negativnih celicah tudi pocasneje popravili. Z morfolosko analizo celic smo pri kombinirani terapiji in vitro pri HPV-pozitivnih celicah opazili vecji delež apoptoticnih in manjsi delež mitoticnih kot pri HPV-negativnih celicah, analiza celicnega cikla pa je pri HPV-pozitivnih celicah pa terapiji pokazala zaustavitev celicnega cikla v fazi G2/M. Posredovane ucinke sevanja smo opazili le pri HPV-pozitivnih celicah po kombinirani terapiji. Zakljucki: V raziskavi smo potrdili, da so HPV-pozitivne celice in tumorji bolj obcutljivi na obsevanje kot HPV-negativni tumorji ter da ima socasna terapija s cisplatinom aditiven ucinek ne glede na HPV status. Na podlagi rezultatov lahko predlagamo 20 % znižanje doze obsevanja pri kombinirani terapiji s cisplatinom pri HPV-pozitivnih tumorjih ploscatocelicnega karcinoma ustnega žrela, pri cemer bi dosegli enako ucinkovitost kot jo dosežemo s standardno dozo pri radiokemoterapiji HPV-negativnih tumorjev. Rezultati raziskave in vitro so pokazali, da je povecana obcutljivost na terapijo med drugim posledica visje ravni poskodb DNA, nižje stopnje popravila teh poskodb, zaustavitve celicnega cikla v fazi G2/M in visje stopnje apoptoze.