Regulación de la virulencia en pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Señalización por Gac-Rsm

Las enfermedades producidas por fitopatogenos constituyen una amenaza para la seguridad alimentaria global, ya que producen perdidas masivas en las cosechas. La bacteria objeto de este estudio es Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto DC3000), que destaca por causar brotes esporadicos del moteado, enfermedad que provoca en sus hospedadores naturales (tomate y cruciferas), y por ser utilizada como modelo para el estudio de la interaccion patogeno-planta junto a Arabidopsis thaliana. En el medio ambiente y en el contexto de la infeccion, los microorganismos necesitan detectar estimulos ambientales, integrarlos y coordinar una respuesta fisiologica adecuada. Esto se logra mediante sistemas de transduccion de senales, como la ruta de senalizacion Gac-rsm presente en γ-proteobacterias donde controla cambios en el estilo de vida o en el estado metabolico celular. La senalizacion comienza con la deteccion de un estimulo desconocido a nivel de la membrana plasmatica por el sistema de dos componentes GacS/GacA, que activa la transcripcion de ARN reguladores rsm que tienen la funcion de secuestrar a la familia de proteinas de union a ARNm CsrA/RsmA. Esta tesis doctoral se centra en el estudio de la ruta Gac-rsm en Pto DC3000, determinando el papel de sus componentes en la interaccion con la planta hospedadora y en la virulencia. Se comenzo estudiando la diversidad y distribucion de las proteinas CsrA dentro del genero Pseudomonas, lo que revelo que CsrA2/RsmA esta presente en todas las cepas, que la presencia de las variantes CsrA1, CsrA2 y CsrA3 esta conservada dentro del linaje P. fluorescens (donde se encuentra P. syringae), que la variante RsmF es exclusiva de P. aeruginosa, y que existen otras muchas variantes todavia no estudiadas ni clasificadas. La variabilidad observada no habia sido descrita anteriormente en ningun otro grupo bacteriano, lo que puede ser explicado por el hecho de que los miembros de este genero son excepcionalmente diversos metabolicamente, ocupan nichos muy diferentes y presentan una gran plasticidad genomica. De los cinco genes codificantes para proteinas CsrA presentes en el genoma de Pto DC3000 (cuatro de ellos previamente anotados y uno identificado en este trabajo) se detectaron los transcritos de csrA2, csrA3 y csrA5 en las condiciones de estudio. En cuanto a la funcionalidad, CsrA3 es el regulador central en esta cepa, favoreciendo por un lado la multiplicacion celular y la acumulacion de acido salicilico en cultivos con deficiencia de hierro y, por otro, reprimiendo la sintesis del biosurfactante siringafactina esencial para motilidad tipo swarming, la produccion del exopolisacarido alginato, la produccion del sideroforo pioverdina en medios con deficiencia de hierro y el ensamblaje del sistema de secrecion de tipo 3 necesario para la virulencia. Todos los procesos regulados por CsrA3 estan tambien controlados por CsrA2, con un efecto mas moderado, mientras que CsrA1 no parece ejercer ninguna funcion. La funcionalidad de CsrA4 y CsrA5 solo se comprobo mediante sobreexpresion. Pto DC3000 codifica siete ARN rsm, cuyos promotores mostraron una actividad variable entre ellos que fue mayor en medios ricos nutricionalmente y que aumento con la densidad celular. La expresion de los promotores fue alta para rsmX3, rsmX5 y rsmY, baja para rsmX1 y rsmZ y variable para rsmX2 y rsmX4. De forma general, se pudieron asociar a los niveles de expresion con las regiones -35 y -10 de sus promotores, mientras que la dependencia de GacA observada se pudo explicar por la cantidad y posicion de los residuos conservados con respecto a la secuencia consenso para la union de este regulador. Ademas, se comprobo la funcionalidad de rsmY y rsmZ, ya que su sobreexpresion desde un plasmido revirtio parcialmente el fenotipo de un mutante gacA. En resumen, este trabajo supone un avance en el conocimiento de la fisiologia P. syringae pv. tomato DC3000 y, en concreto, del funcionamiento de su compleja ruta Gac-rsm y su papel en la interaccion de esta bacteria con la planta. Se ha revelado la regulacion de multiples procesos celulares y genes a traves de esta ruta y se ha profundizado en el estudio de la expresion y funcion especifica de las cinco proteinas CsrA y los siete ARN reguladores rsm.