La secretion des proteines chez bacillus subtilis : une approche transcriptionnelle

Le theme de recherche de ma these s'inscrit dans le cadre de l'etude de la secretion des proteines chez bacillus subtilis. Je me suis interesse en particulier a la modulation de l'efficacite de secretion de proteines natives exocellulaires de cette bacterie gram positif. La mutation pleiotrope degu32(hy) est responsable du phenotype d'hyperproduction de la levane saccharase exocellulaire (85% des proteines secretees) dans les conditions de pleine induction de la synthese. Cette production a permis la mise en evidence d'un processus de secretion a deux etapes. La generalisation de ce processus a ete etablie pour plusieurs proteines modeles natives exocellulaires de b. Subtilis, la chitosanase (csn), l'alpha-amylase (amye) et la levanase (sacc). Des fusions transcriptionnelles des genes de structure de ces proteines au locus regulateur de la levane saccharase (sacr) permettent en la surproduction de ces proteines comparativement a leur production sous le controle de leur propre promoteur. Cependant dans ces conditions, les niveaux de secretion de ces proteines sont differents (2 a 10 fois plus faibles que celui de la levane saccharase (sacb)). J'ai etudie le niveau transcriptionnel des differentes fusions a l'etat stationnaire ainsi que la decroissance des differents transcrits, j'ai ainsi demontre la correlation entre les niveaux de production des proteines et la stabilite de leur messager. Je me suis plus particulierement interesse a la fusion sacrsacc pour laquelle l'instabilite est la plus grande et le rendement proteique le plus faible. L'insertion de sequences shine dalgarno dans la region 5 de l'arnm a permis d'augmenter significativement la demi-vie du messager de la fusion sacrsacc et la production de levanase par un facteur 4, confirmant ainsi l'hypothese qu'une fixation des ribosomes en 5 du transcrit protege celui-ci de la degradation endonucleolytique. La seconde partie de mon travail a consiste a caracteriser le transcriptome du mutant degu32 (hy), utilise dans cette etude, a l'aide des membranes haute densite (dna arrays). Cette etude a etabli pour la premiere fois le role activateur de la proteine degu sur sa propre transcription. Les niveaux de transcription des proteines secretees ou predites comme telles ont ete compares dans le mutant et la souche sauvage de reference. Par ailleurs, le croisement de ces donnees avec celles d'une analyse proteique partielle des surnageants de culture des deux souches a montre des differences entre les niveaux de transcription et les profils de secretion de certaines proteines suggerant un role de constituants de la paroi, affectes dans le mutant, soit au niveau de modifications de l'association avec la membrane ou la paroi soit dans le repliement de ces proteines. Enfin, l'analyse des donnees du transcriptome confortee par des experiences de northern blotting a montre l'existence d'un operon tricistronique levane saccharase (sacb, yveb, yvea) implique dans le metabolisme des levanes (synthese et degradation). Yveb a ete caracterisee comme une endolevanase (levb) ancree dans la membrane, dont l'activite, associee a l'activite exolevanase de sacb, permet la degradation complete des levanes. Yvea est une proteine membranaire presentant les caracteristiques d'une permease.