Caracterização de lipopeptídeos antimicrobianos e surfactantes produzidos por Bacillus spp. isolados de puba

Alimentos naturalmente fermentados como a puba constituem uma fonte de micro-organismos produtores de compostos antimicrobianos. Diversos produtos de interesse industrial sao produzidos por bacterias do genero Bacillus e incluem enzimas, antibioticos, aminoacidos,inseticidas, biossurfactantes e bacteriocinas. Neste estudo, caracterizaram-se lipopeptideos com acao antimicrobiana e biossurfactantes produzidos pelas linhagens Bacillus spp. C3 e P5, isoladas da matriz alimentar de Puba, tendo sido escolhido um micro-organismos destes, conforme maior atividade antimicrobiana, para o prosseguimento dos experimentos. A identificacao das duas bacterias foi realizada por testes fenotipicos, quimiotaxonomicos e genotipicos indicando que pertencem ao genero Bacillus e Bacillus spp. C3 a especie B. cereus/B. thuringiensis e Bacillus sp. P5 a especieBacillus subtilis/amyloliquefaciens. O espectro de atividade antimicrobiana foi realizado para ambas as linhagens de Bacillus spp. Para os testes de atividade antimicrobiana de Bacillus spp. P5 utilizaram-se micro-organismos (45) que incluiram bacterias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos filamentosos e uma levedura, em que foi observada atividade antimicrobiana frente a62% (28) dos micro-organismos testados, enquanto que Bacillus spp. C3apresentou apenas 15% de atividade antimicrobiana contra as especies para que foi testado. Um aumento da atividade antimicrobiana foi detectadoquando Bacillus spp. P5 foi cultivado juntamente com celulas inativadas de outros micro-organismos mas nao quando em contato com o sobrenadante destes, com maiores atividades para Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, Lactobacillus brevis E4-248, Lactobacillus fermentum E4-249 e Lactobacillus plantarum EPF-257. Estes resultados indicam que ha interferencia de fatores de inducao - quorum sensing, especialmente quando os micro-organismos sao provenientes da microbiota natural deste alimento fermentado, aumentando a producao da(s) substância(s) antimicrobiana(s) produzida por Bacillus spp. P5. O sobrenadante bruto de Bacillus sp. P5 apresentou acao bacteriostatica contra Bacillus cereus ATCC 14579 e contra Listeria monocytogenes ATCC 6477. A caracterizacao da atividade biossurfactante foi detectada pela zona de beta hemolise ao redor da colonia, pelos testes de atividade emulsificante e pela medicao da tensao superficial. Foi obervada atividade emulsificante do sobrenadante para todos os agentes hidrofobicos testados (4), com 30 excecao do xileno, sendo este capaz de formar emulsao apenas quando testado o sobrenadante em meio Landy acrescido de glutamato.Tambem foi observada reducao da tensao superficial do meio de cultura, sugerindo a producao de compostos tensoativos pela linhagem de Bacillus spp. P5. A tecnica de PCR seguida de sequenciamento dos amplicons permitiu identificar genes relacionados a sintese das bacteriocinas subtilosina A e subtilina para Bacillus sp. C3, constituindo o primeiro registro da presenca destes genes para a especie Bacillus thuringiensis/B. cereus, a qual posssivelmente pertence Bacillus sp. C3 e de subtilosina A e dos lipopetideos iturina A e surfactina para Bacillus sp. P5. Dentre as tecnicas de purificacao empregadas neste trabalho as que apresentaram melhores resultados foram a extracao como butanol, seguidas por cromatografia de fase reversa em coluna C18 acoplada ao HPLC e espectrometria de massas MALDI-TOF para a pesquisa no sobrenadante da cultura. Para a pesquisa das substâncias diretamente na matriz alimentar substituiu-se a cromatografia de fase reversa atraves de coluna C18 e adaptou-se o metodo de extracao com butanol com a utilizacao de coluna C4 (zip tip). O isolado Bacillus sp. P5 e capaz de co-produzir cinco (5) diferentes tipos de lipopeptideos (surfactina, fengicina, iturina, micosubtilina e bacilomicina) e, portanto, apresenta diferentes atividade de biocontrole. Alem disso, este trabalho demonstrou a elevada producao de diferentes isoformas de surfactina (de C13- C17), em meio de cultura, incluindo a isoforma C15, biologicamente a mais ativa e a isoforma C17, raramente descrita, bem como a deteccao inedita de lipopeptideos como fengicina e iturina diretamente na matriz alimentar de puba de mandioca. Este alimento e amplamente consumido por populacoes no norte e nordeste do Brasil e o conhecimento acerca destas substâncias poderia contribuir para o aumento da seguranca alimentar e da vida de prateleira deste tipo de alimento.