Protein structure and function studied by NMR spectroscopy and MD simulations

Rentgenova difrakce a nuklearni magneticka resonance (NMR) jsou dvě hlavni techniky použivane pro urcovani struktury makromolekul na atomarni urovni. V mnoha připadech je funkce makromolekul zavisla na tranzitnim stavu. V těchto připadech je dynamický popis nezbytný k pochopeni funkce molekuly. NMR a molekularně dynamicke (MD) simulace jsou techniky použivane k propojeni staticke struktury a dynamiky nutne pro funkci makromolekul. Tato prace byla zaměřena na vyřeseni struktury Mason-Pfizer opiciho viru pomoci NMR spektroskopie a na interpretaci rozdilů v NMR dynamických parametrech mezi APO- a HOLO- (s navazaným proteinem) formou hlavniho mysiho proteinu-I na atomarni urovni pomoci MD simulaci. Pomoci NMR byla vyřesena struktura s vysokým rozlisenim N-terminalni domeny (NTD) retroviralniho kapsidoveho proteinu (CA) z Mason-Pfizerova opiciho viru (M-PMV), patřiciho do druhu Betaretrovirů. Struktura M-PMV NTD CA je podobna strukturam ostatnich retroviralnich kapsid a je charakterizovana svazkem sesti alfa-helixů a N-terminalni vlasenkou, ktera je stabilizovana interakci mezi vysoce konzervovanými residui, Pro1 a Asp57. Vzhledem k tomu, že byla prokazana kriticka role beta-vlasenky pro formaci infekcniho viroveho jadra, byla zkoumana funkce M-PMV beta-vlasenky dvou mutantů, dP1NTDCA a D57NTDCA, v nichž byl narusen solný můstek stabilizujici strukturu divokeho typu. NMR data ziskana pro tyto dva mutanty byla porovnana s daty divokeho typu. Hlavni strukturni změny byly pozorovany v beta-vlasence, v helixech 2, 3 a 5, a ve smycce spojujici helixy 2 a 3. Tato pozorovani jsou podpořeny biochemickými daty ktera ukazuji rozdilne stěpeni mezi divokým typem a mutovaným kapsid-nukleokapsid fůznim proteinem (CANC) pomoci M-PMV proteasy. Navzdory strukturnim změnam jsou mutanty s naruseným solným můstkem schopny se poskladat do nezrale sfericke castice. Tato pozorovani potvrzuji, že vzajemna interakce a topologie mezi beta-vlasenkou a helixem 3 může korelovat se změnami v interakcich mezi nezralým a zralým uspořadanim. Molekularni vibrace volne a vazane formy mysiho mocoveho proteinu-I dřive stanovene pomoci měřeni NMR relaxaci byly simulovany pomoci MD po dobu 30ns. Ohebnost pateře byla popsana na zakladě parametru uspořadani běžně použivaneho při interpretaci NMR relaxaci. Pozornost byla věnovana vlivu konformacni výměny při nanosekundove casove skale. Pro rozliseni pohybů na odlisných casových skalach byly vypocitany casově zavisle parametry uspořadani. Byl aplikovan alternativni způsob urceni pomale konformacni výměny na zakladě variance torznich uhlů pateře. Pro dobře definovane konformacni stavy byly vypocitany konformacně filtrovane parametry uspořadani. Srovnani dat ziskaných pro apo formu a formu s navazaným feromonem se ukazalo, že některa residua jsou vice rigidni ve vazane formě, nicmeně větsi cast proteinu svou ohebnost zvýsi po navazani feromonu. Tyto výsledky jsou v souladu s NMR experimentem. Zvýsena ohebnost pozorovana na (fs-ps) casove skale byla typicky pozorovana u aminokyselinových zbytků s vyssi konformacni volnosti na ns casove skale. Na atomarni urovni jsou zmeny v ohybnosti vysvětleny rozdilným uspořadanim vodikových vazeb mezi apo formou a formou s navazaným feromonem.