Participación de los neutrófilos en la gestación: efectos moduladores de las células trofoblásticas y el VIP

El mantenimiento de la homeostasis inmunologica durante el embarazo requiere multiples circuitos de regulacion a nivel local y sistemico que actuan en forma sincronizada desde el periodo post-implantatorio hasta el parto. Diversas poblaciones de celulas inmunes son reclutadas a la interfase materno-placentaria desde el inicio de la gestacion y su funcion es modulada en gran medida por factores solubles y de contacto de las celulas trofoblasticas. Desde el punto de vista inmunologico, el desarrollo del embarazo normal comprende tres fases caracterizadas por distintos microambientes o perfiles predominantes. Una primera etapa proinflamatoria, asociada a los procesos de implantacion y placentacion temprana. Esta etapa involucra la ruptura del epitelio uterino, la invasion del endometrio por el blastocisto y la remodelacion de los vasos maternos, necesaria para satisfacer la creciente demanda de oxigeno y nutrientes. Esta respuesta inflamatoria inicial esta estrictamente controlada para mantener la homeostasis a traves de la activacion de respuestas antiinflamatorias y tolerogenicas. A continuacion, pasadas las 14 semanas, se inicia la segunda fase con un cambio de perfil hacia uno predominantemente antiinflamatorio requerido para el crecimiento fetal. Finalmente, una tercera etapa mucho mas corta en duracion, se caracteriza por una respuesta proinflamatoria asociada al desencadenamiento del parto. Distintos mediadores solubles como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y hormonas regulan estos cambios de perfil, actuando sobre multiples celulas blanco entre las cuales los monocitos, macrofagos, celulas dendriticas y linfocitos T han sido extensamente estudiados. Entre los factores inmunomoduladores de sintesis local, es de particular interes el peptido intestinal vasoactivo (VIP), un peptido pleiotropico que es sintetizado por celulas trofoblasticas, entre otras celulas de la interfase materno-placentaria. El objetivo de la presente tesis es investigar mecanismos celulares y moleculares que condicionan el fenotipo de los neutrofilos y su interaccion con celulas trofoblasticas con especial foco en la participacion del sistema VIP y sus receptores VPAC. Para abordar este objetivo se emplearon dos disenos principales, por un lado disenos in vitro con celulas humanas utilizando neutrofilos y monocitos de dadores sanos y lineas celulares derivadas de trofoblasto humano de primer trimestre (Swan-71 y HTR8-SVneo). Por otro lado, para profundizar en los efectos de VIP y sus receptores, se emplearon dos cepas de raton geneticamente modificadas que no expresan los receptores VPAC1 o VPAC2 de dicho peptido. En primer lugar, demostramos que los neutrofilos humanos expresan ARN mensajero de los dos receptores VPAC1 y VPAC2. Observamos que el VIP y los medios condicionados de celulas trofoblasticas (MC) inhiben la formacion de trampas extracelulares de neutrofilos (NETs) inducidas por el forbol miristato acetato (PMA), con disminucion en la liberacion de ADN y elastasa. Esta disminucion en la NETosis es acompanada por un aumento de la apoptosis. Mas aun, vimos que el VIP y los MC inhiben la liberacion de mieloperoxidasa inducida por PMA. Hallamos que el VIP y los MC de las dos lineas trofoblasticas Swan-71 y HTR8 disminuyen la formacion de especies reactivas de oxigeno (ROS) inducida por el PMA. A su vez, los efectos inhibitorios de liberacion de ROS y ADN fueron prevenidos por un antagonista de receptores de VIP. Demostramos que tanto el VIP como los MC inhiben parcialmente la autofagia inducida por PMA. Por otra parte, el VIP y los MC aceleran la apoptosis espontanea de neutrofilos y revierten el efecto antiapoptotico del LPS. En cuanto al papel del VIP trofoblastico, observamos que los MC de celulas trofoblasticas deficientes en VIP no inducen el efecto proapoptotico sobre los neutrofilos. Asimismo, se observo una mayor fagocitosis de neutrofilos apoptoticos por monocitos cuando los primeros habian sido cultivados con MC, comparado con aquellos incubados en RPMI. En la segunda parte de la tesis, estudiando las cepas deficientes en los receptores VPAC1 y VPAC2, encontramos que las cruzas VPAC1 KO x VPAC1 KO tienen una menor cantidad de crias al nacer, y la cruza VPAC2 KO x VPAC2 KO presenta la misma tendencia. Tambien vimos en ambas cepas una asimetria marcada en la distribucion de los sitios a lo largo del utero. Estos sitios presentan una menor expresion del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en ambas cruzas y las celulas trofoblasticas gigantes aisladas de los sitios tienen expresion alterada de factores relacionados con la angiogenesis: VEGF, angiopoyetina 1 y metaloproteinasa 9. Los sitios de implantacion tambien presentan una alteracion en factores relacionados a la regulacion de la respuesta inmune como la proteina quimioatrayente de monocitos 1, el marcador F4/80 y el factor plaquetario 4. Finalmente, al aislar neutrofilos de hembras VPAC1 y VPAC2 knock out prenadas observamos que tienen alterada su tasa de apoptosis y su capacidad de modular estimulos activadores como el PMA. Los macrofagos tambien presentan diferencias en su perfil. Concluimos que factores liberados por las celulas trofoblasticas inhiben la activacion de los neutrofilos y promueven su apoptosis. Los resultados indican que, entre dichos factores, el VIP liberado por las celulas trofoblasticas tiene un papel relevante y que otros factores producidos por estas celulas a traves de mecanismos mediados por el VIP endogeno, tambien contribuyen a la desactivacion.