花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β—1，3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白（PR蛋白），容易受到激发子的诱导而积累。用1．5mmol／L水杨酸（SA）对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理0．5、12、24、36、48和72h后，提取RNA进行荧光定量检测岱-1，3-葡聚糖酶基因（Ah．Glu）的表达量。结果表明，经诱导24h后β-1，3-葡聚糖酶基、因的表达量达到最高，是未经sA诱导的1．8倍。根据前期已克隆的花生B．1，3．葡聚糖酶基因序列（GenBankJQ801335），在其5’端设计3个嵌套的特异性引物扩增其上游启动子序列。以花育20号基因组DNA为模板，利用TAIL—PCR方法，扩增得到973bp的花生13-1，3-葡聚糖酶基因启动子片段，在NCBI网站注册序列号为GenBankKC290400，并命名为Ah-Glu-Pro.PLACE和PlantCARE在线预测分析表明，Ah—Glu—Pr。序列中含有TATA—box和CAAT—box等核心元件，还合有病原菌及水杨酸响应的顺式调控元件。根据Ah—Clu—Pro序列设计上下游引物，采用普通PCR法从花育20号扩增得到93lbp的启动子序列，命名为Ah—Glu—P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIAl301质粒中的CaMV35S启动子，构建植物表达载体pCAMBIA1301-Ah-Glu—P。通过农杆菌介导法将pCAMBIAl301-Ah-Glu—P转化洋葱表皮细胞，经5mmol／LSA诱导处理48h后进行GUS染色。结果表明：经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色显示为蓝色，未经sA诱导的洋葱表皮细胞GUS组织化学染色未显示蓝色，说明Ah—Glu—P是一个可被诱导的启动子，可能含有对sA响应的顺式调控元件。