6-OHDA诱导过表达nurr1基因的SK-N-SH细胞凋亡

目的比较自身不表达核相关受体因子（nuclear receptor related factor1,Nurr1）基因的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH和过表达外源性nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）的损伤反应,探讨nurr1基因在6-OHDA致细胞损害（死亡或凋亡）中的作用。方法用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测基因转染细胞SK-N-SH/NURR1的nurr1蛋白及NURR1 mRNA的表达。细胞经不同浓度6-OHDA（50～100μmol/L）作用不同时间（6、12 h）,经AnnexinV/PI双染后流式细胞术（flow cytometry,FCM）测定早期细胞凋亡比例。细胞经75μmol/L 6-OHDA作用12 h,通过透射电镜（transmission electronmicroscopy,TEM）观察细胞超微结构变化。用Western blotting方法检测75μmol/L6-OHDA作用6、12 h,细胞凋亡因子Caspase-3活性前体蛋白的表达水平。结果免疫细胞化学染色结果显示,基因转染细胞SK-N-SH/Nurr1表达NURR1蛋白;经RT-PCR检测,基因转染细胞表达NURR1 mRNA,说明外源性nurr1基因在转染细胞内过表达。FCM检测结果显示,75μmol/L 6-OHDA作用12 h,SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡比例明显高于SK-N-SH细胞（P=0.000）,而100μmol/L6-OHDA作用6、12 h后,2株细胞均表现为毒性损伤。TEM显示,75μmol/L6-OHDA作用12 h后,部分SK-N-SH/Nurr1细胞出现了典型凋亡改变,而SK-N-SH细胞主要表现为毒性损伤。4.75μmol/L6-OHDA作用6、12 h,SK-N-SH/Nurr1细胞Caspase-3活性前体蛋白表达显著下降（P=0.000）,而SK-N-SH细胞Caspase-3活性前体蛋白表达变化不明显。结论外源性nurr1基因过表达促进6-OHDA诱导的SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡,在低剂量（≤75μmol/L）时,凋亡比例与剂量呈正相关,高剂量时6-OHDA主要诱导细胞毒性损伤。